研究细胞选择性自噬起始的方法

一、背景

       自噬对细胞内稳态至关重要，但选择性自噬——即针对特定细胞器如线粒体的降解机制尚不明晰。现有研究揭示了自噬小体形成的复杂过程，但底物识别与自噬启动间的联系及靶向特定细胞器的机制仍属未知。特别是，ULK1复合体作为自噬的启动者，其在选择性自噬中的激活方式尚未明确。本文聚焦于选择性自噬形成的早期阶段，探讨这一过程的关键环节。

二、结果

1. 化学诱导蛋白定位法研究NDP52介导的有丝分裂吞噬作用

自噬对细胞内稳态至关重要，但选择性自噬——即针对特定细胞器如线粒体的降解机制尚不明晰。现有研究揭示了自噬小体形成的复杂过程，但底物识别与自噬启动间的联系及靶向特定细胞器的机制仍属未知。特别是，ULK1复合体作为自噬的启动者，其在选择性自噬中的激活方式尚未明确。本文聚焦于选择性自噬形成的早期阶段，探讨这一过程的关键环节。

作者通过化学诱导法将NDP52定位到线粒体上，不干扰细胞代谢，成功观察到线粒体溶酶体形成。在PINK1缺失细胞中，NDP52的异位募集仍能诱导线粒体自噬，表明此过程不依赖PINK1/Parkin通路。NDP52定位后招募了包括FIP200、ATG14和ATG16L1在内的ATG蛋白，这些蛋白参与自噬小体成熟，证明NDP52的靶向足以启动选择性自噬。

2. NDP52通过FIP200与ULK1复合物相互作用

作者进一步发现，内源性NDP52与ULK1复合物（包括ULK1激酶、ATG13和FIP200）存在结合关系。在Parkin介导的线粒体自噬中，NDP52与ULK1复合物的结合显示出特异性，因为当FIP200缺失时，NDP52无法与ULK1结合，这表明确切的结合路径是NDP52通过FIP200与ULK1复合物相连。

3. NDP52-FIP200相互作用的功能分析

作者通过突变定位实验确认了NDP52与FIP200的相互作用。NDP52的SKICH结构域缺失阻断了其与FIP200的结合，而FIP200的C-末端则被鉴定为与NDP52结合的关键区域。这表明NDP52的SKICH结构域与FIP200的结合对于NDP52诱导的线粒体自噬底物定位至关重要。此外，仅FIP200的C-末端包含亮氨酸拉链结构域的肽段也足以与NDP52结合，进一步证实了这一相互作用的特异性。

4. NDP52介导不依赖LC3的自噬小体发生

现有自噬模型认为自噬受体如NDP52通过泛素和LC3结合促进自噬。但研究发现，LC3非自噬体靶向必需，而对自噬体与溶酶体融合关键。作者提出NDP52等自噬受体在底物上直接启动自噬膜形成，可能是底物识别与自噬起始间的关键。进一步实验显示，将ULK1复合物通过FIP200结合肽定位到底物也能诱导选择性自噬，挑战了传统通过LC3和泛素化降解底物的模型。

5. ULK1在底物上的异位定位驱动选择性自噬的发生，而不依赖于能量感知途径

作者深入探讨了ULK1在选择性自噬中的激活机制。他们首先排除了AMPK作为ULK1激活因子的可能性，因为AMPK缺失并未影响PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。同时，确认ULK1/2激酶活性对于该过程至关重要。进一步，研究发现ULK1在底物上的定位足以启动自噬，且这一过程不依赖于AMPK。

接着，作者考察了mTOR对ULK1的抑制作用。在能量充足时，mTOR磷酸化ULK1以抑制其自噬活性。然而，实验显示，即便在mTOR活跃状态下，通过将ULK1定位至底物也能绕过其抑制作用，启动选择性自噬。

综上所述，作者得出结论：ULK1在底物上的激活是独立于AMPK和mTOR活动的，暗示存在其他未知的激活机制。

6. TBK1通过促进NDP52-ULK1复合物结合正向调节线粒体自噬

研究表明NDP52诱导线粒体自噬需与FIP200/ULK1复合物互作。TBK1磷酸化NDP52，增强其底物结合和滞留，同时促进NDP52与ULK1复合物结合。TBK1在底物上的定位激活了ULK1的上游，而不受ULK1/2抑制剂影响，说明TBK1在NDP52招募和激活ULK1中起关键作用。

7. 嵌合FBD-Parkin可以补偿线粒体自噬过程中TBK1或受体蛋白的丢失

线粒体损伤激活PINK1/Parkin通路，导致泛素化。但化学诱导法绕过此途径，TBK1和自噬受体对线粒体自噬关键。FBD-Parkin在KO细胞中恢复线粒体自噬，但FBD突变体或线粒体定位缺陷的Parkin突变体则无效。这表明TBK1和NDP52的关键作用是将ULK1复合物导向泛素化底物。

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