细胞或组织蛋白提取方法

一、细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法）

培养基移除与清洗：轻吸去培养基，加入1ml预冷PBS洗三次，确保细胞表面干净。

细胞裂解准备：根据培养皿大小加含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（10cm皿约500μl，六孔板每孔约100μl），覆盖细胞。

冰上裂解与收集：冰上裂解15-30分钟，刮取细胞并转移至1.5ml离心管。

离心分离蛋白：4℃下12,000rpm离心15分钟，取上清液为细胞总蛋白，用于后续分析。

二、小鼠组织总蛋白提取

组织样本准备：取小鼠组织50-200mg，加入500µl预冷含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。

组织破碎与匀浆：剪碎组织并使用匀浆器处理，确保细胞破碎并释放蛋白。

冰上裂解：混合物冰上静置30分钟，促进蛋白质溶解并防止降解。

离心分离：4℃下12,000rpm离心30分钟，取上清液为组织总蛋白，供后续分析或储存。

三、蛋白浓度测定（BAC法）

工作液配制：按50:1混合BCA与Cu试剂得工作液。

标准品准备：4 mg/ml BSA稀释成系列浓度梯度作为标准品。

样品反应：96孔板每孔加100μL工作液+5μL样品/标准品，混匀后37℃孵育30分钟或室温延长。

测定与计算：酶标仪测595nm吸光度，软件拟合标准曲线并计算蛋白浓度。

注意：保持操作一致，准确控制孵育条件。

       RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。（感觉这个总结不错）弱的裂解液适合做co-ip，如果是胞浆蛋白，对裂解液强度要求不高，如果是膜蛋白，要强裂解液。加了SDS裂解能力就比较强。

强效版：含Tris、NaCl、TritonX-100、脱氧胆酸钠（裂解细胞，溶解难溶蛋白）、SDS、焦磷酸钠（缓冲剂，磷酸酶抑制）、β-甘油磷酸钠（磷酸酶可逆抑制）、EDTA（螯合剂，抑制核酸酶和某些蛋白酶）、Na3VO4（抑制酪氨酸磷酸酶）及多种抑制剂，有效防蛋白降解。

中效版：简化成分，含Tris、NaCl、NP-40（温和去垢剂，破坏细胞膜）、少量脱氧胆酸钠，适用于不同需求。

关键成分作用：

脱氧胆酸钠：强效离子型去垢剂，助裂解与溶解蛋白。

Na3VO4：抑制酪氨酸磷酸酶活性。

焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠：作为缓冲剂和磷酸酶抑制剂。

NP-40：温和非离子型去垢剂，适合膜蛋白溶解。

PMSF、EDTA：分别抑制丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶、去除金属离子干扰。

选择裂解液要点：依据目标蛋白位置、实验目的，考虑裂解液成分及是否需添加蛋白酶、磷酸酶抑制剂。

BCA法测蛋白浓度：利用双缩脲反应原理，在碱性条件下蛋白质还原Cu2+为Cu+，生成紫蓝色复合物，其吸光度与蛋白浓度成正比，常用于蛋白定量。

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