细胞稳定转染操作步骤

      慢病毒转染技术作为细胞稳定转染的有效策略，能精准地将目标基因序列整合至宿主细胞DNA，确保基因在细胞内的持久稳定表达。该技术跨细胞系广泛适用，高效传递基因，并为基因功能深入探索及细胞工程改造提供了不可或缺的基石。

      早在1981年，科学家们发现并研究了人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），从而掀开了慢病毒作为载体的研究序幕。慢病毒（Lentivirus）载体是通过对HIV-1进行改造而得到的，其具备感染细胞的能力，包括分裂期和非分裂期细胞，同时在宿主体内能够实现长期表达且具备较高的安全性。这种载体能够稳定表达外源基因，具有广泛的感染范围等优势，因此在基因过表达、RNA干扰、miRNA研究等实验中得到广泛应用。

一、实验步骤

1.提前一天准备细胞

转染前，对293T细胞进行胰酶消化，铺于10厘米培养皿，确保70%-80%贴壁密度。之后，将细胞置于37℃、5% CO2环境孵育8-24小时，待细胞稳固贴壁，即达转染适宜状态，准备进行转染步骤。

2. 转染

（1）转染前，需换液，使用10毫升完全培养基替换旧的培养基。

（2）制备混合物包括包装质粒和目的质粒与转染试剂；

a. 将8µg 目的质粒和16µg 病毒包装质粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)加入到1ml 无血清Opti-DMEM，充分混合；

b. 将50µl转染试剂溶于1ml Opti-DMEM中，充分混合，静置5分钟；

c. 将转染试剂稀释后逐滴加入质粒稀释液中，边加边轻搅，室温静置20分钟促DNA与试剂结合成稳定复合物。随后，将此复合物轻柔加入培养皿中，混匀，标记，并重新置于培养箱中继续培养。

（3）经过6~8小时后，吸除培养基，用4ml PBS清洗一次，然后加入8ml 新鲜完全培养基进行培养。

3. 收病毒
转染后，每隔24小时收集培养上清，并标记后更换新培养基。完成所有病毒液收集后，所有接触病毒的器材，如枪头、离心管及培养皿，需用84消毒液彻底浸泡消毒，确保生物安全后，方可按规范程序安全处置，以维护实验室的卫生与安全标准。

4. 包装病毒

贴壁细胞：

（1）在慢病毒转染前夕，预先将贴壁细胞铺板至24孔板，确保各孔细胞密度约为2×10^5个。次日，以含6 μg/ml polybrene的新鲜培养基2毫升替换旧液，并加入适量的病毒悬液，于37℃下共孵育。

（2）针对polybrene敏感的细胞系，转染后迅速以2毫升新鲜培养基稀释，以减少其毒性影响，此操作需在4小时内完成。

（3）维持培养24小时后，更换全新培养基，以去除残留病毒及代谢产物。

（4）继续细胞传代培养，若病毒携带荧光标记，则转染后48小时可见荧光初步显现，至72小时更为显著。若病毒整合有抗性基因，则转染后3-4天可启动药物筛选程序，以筛选稳定转染的细胞株。

悬浮细胞：

（1）将6 μg/ml浓度的polybrene直接融入含2×10^5/ml悬浮细胞的体系中，并添加适量病毒，彻底混匀后，置于37℃环境中孵育。对于难以转染的细胞类型，可选择额外进行室温下的低速离心（150g，持续4小时），以增强转染效率。

(2）针对polybrene敏感细胞，转染操作完成后4小时内，需迅速补充等体积的新鲜培养基，以有效稀释polybrene浓度，减轻其潜在毒性。

(3）继续培养细胞3至4天，期间根据细胞生长状况灵活调整，包括进行必要的细胞传代操作或适时更换新鲜培养基，以确保细胞健康生长及转染效果。

二、注意事项

1、在进行慢病毒实验时，务必遵循安全规范，穿戴实验服、口罩及手套，确保个人防护到位。

2、处理病毒时应极度谨慎，防止气雾或飞溅产生，所有与病毒接触的工具及培养液均需经84消毒液长时间浸泡消毒后，方可安全处置。

3、病毒操作环境应首选生物安全柜，若条件有限使用超净工作台，则需关闭风机以减少风险。

4、若Puromycin处理后细胞死亡率高，应立即更换培养基，避免死细胞释放的毒性物质影响抗性细胞生长。

5、关于病毒液储存，短期内（3天内）可置4℃冰箱暂存；长期保存则需分装至冻存管，-80℃冷冻，标记清晰，密封良好，可保存约6个月。分装时应根据用量精确分配，确保每次使用的便捷与安全。

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