双光子显微镜技术下胶质瘤-壁细胞在体多荧光示踪小鼠模型的建立及应用

目的: 建立双光子显微镜下可视化胶质瘤、壁细胞和血管的活体自发荧光的基因小鼠模型并进行评价。

1. 材料

1.1 实验动物

种类与数量：

雄性B6.Cg-Pdgfrbtm1.1(cre/ERT2)Csln/J小鼠（简称PDGFRβ Cre+/+），10只，812周龄，体重1824g。

雌性B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠（简称Rosa26-tdtomato+/+），30只，812周龄，体重1824g。

配种与繁育：

PDGFRβ Cre+/+与Rosa26-tdTomato+/+配种繁育的子代用于实验研究。

饲养环境：

SPF级屏障环境，提供不受限制的食物和水。

温度控制：22~25℃。

相对湿度控制：40%~70%。

明暗周期：12h/12h，建立昼夜节律。

1.2 细胞系

名称与来源：

GL261小鼠胶质瘤细胞系，来源于北京协和医学院细胞资源中心（PCRC）。

支原体检测：

采用DAPI染色法检测。

培养条件：

含10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养。

1.3 主要试剂与仪器

试剂：

RPMI-1640培养基、胎牛血清、麻醉剂异氟烷、FITC-dextran（HY-128868I）、CFP慢病毒、复方氯胺酮注射液、青霉素、脱毛膏、眼膏、牙科水泥乙基氰基丙烯酸酯液体（DW6993443, HAGER）、美洛昔康注射液

仪器：

手术器械、立体定位仪、Hamilton注射针筒、注射器针头-6 cm尖头31G、台式双目体视显微镜、微型手持颅钻、钻头0.5 mm HM1005-圆头、300g热玻璃珠灭菌器、Cover Slips玻璃圆片、TCS SP8 DIVE双光子共聚焦显微镜

2. 方法

2.1 基因工程小鼠的繁殖与鉴定

实验目的

通过杂交壁细胞特异性PDGFRβ-Cre+/+小鼠与Rosa26-tdTomato+/+小鼠，生成能在Tamoxifen诱导下特异性表达tdTomato红色荧光蛋白的PDGFRβ-Cre+/-; Rosa26-tdTomato+/-小鼠，用于后续实验。

实验步骤

1.小鼠杂交：

将PDGFRβ-Cre+/+小鼠与Rosa26-tdTomato+/+小鼠进行杂交。

通过Tamoxifen诱导，使得子代小鼠（PDGFRβ-Cre+/-; Rosa26-tdTomato+/-）的壁细胞特异性表达tdTomato红色荧光蛋白。

2.PCR鉴定：

使用特定引物对小鼠进行PCR鉴定，确认基因型。

PDGFRβ-Cre PCR引物：

野生型引物：

5’-AGCTTGTGGCAGTGTAGCTG-3’

突变型引物：

5’-ACATGTCCATCAGGTTTCTTGC-3’

共用引物：

5’-CCACCTTGAATGAAGTCAACAC-3’

Rosa26-tdTomato PCR引物：

野生型正向引物： 

5’-AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA-3’

野生型反向引物：                 

5’-CCGAAAAATCTGTGGGAAGTC-3’

突变正向引物：

5’-CTGTTTCCTGTACGGCATGG-3’

突变反向引物：

5’-GGCATTAAAAGCAGCGTATCC-3’

3.PCR反应体系：

20 μL反应体系中包含10 μL PreMix TaqTM(TaKaRa 2.0 plus dye)、2 μL鼠尾基因组DNA、1 μL 10 nmol/L前向引物和反向引物，最后加入6 μddH2O。

4.PCR程序：

· 95 ℃初始变性5 min

· 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共35个循环

· 72 ℃延长10 min

2.2 慢病毒感染实验

实验目的:

通过慢病毒感染GL261细胞，使其稳定表达CFP，用于后续实验。

实验步骤:

1.细胞培养：

· 制备5 × 10^4 /mL的GL261细胞悬液，并在6孔板中每孔接种2 mL。

· 37 ℃培养24 h。

2.慢病毒感染：

·在MOI = 100的条件下加入CFP慢病毒，继续培养16 h。

·中途换液保持细胞活性。

3.筛选稳定表达细胞：

感染约72 h后，加入500 μg/mL G418筛选至稳定。

2.3 器官组织形态学观察

目的：

观察C57BL/6和PDGFRβ Cre+/-;Rosa26-tdTomato+/-小鼠各器官的组织形态。

步骤：

1.取小鼠的脑、心脏、肺、肝、脾和肾等器官，固定于4%多聚甲醛中48小时。

2.脱水、透明、石蜡包埋后，进行苏木素伊红(HE)染色。

3.在光学显微镜下拍照观察。

2.4 玻璃颅窗动物模型的手术制备方法

目的：

为小鼠制备玻璃颅窗，以便进行后续实验观察。

步骤：

1.提前4周准备颅窗，使用异氟烷气体麻醉小鼠。

2.剪去头皮，磨去颅骨，挑去硬脑膜。

3.使用直径6mm的透明颅窗覆盖大脑，并用牙科水泥密封。

4.术后皮下 注射4剂镇痛药:每隔6 h注射一剂美洛昔康注射 液(0.1 mg/kg)。第-2、-1、0天每天腹腔注射一剂 他莫昔芬(75 mg/kg),在第3、5、7、14天使用双光子 活体动态跟踪观察,见图1。

2.5 胶质瘤活体动物模型制备方法

目的：

在小鼠脑内注射GL261-CFP细胞，制备胶质瘤活体动物模型。

步骤：

1.在已制备玻璃颅窗的小鼠上，去除玻璃片和固定环。

2.使用汉密尔顿微量注射器和针头，将GL261-CFP细胞悬液以特定速度和深度注射到小鼠脑内。

3.注射后停留片刻，然后缓慢退针。

4.清洁脑表，用牙科水泥固定玻璃圆片。

5.。术后皮下注射4针镇痛药:每隔6 h 注射一剂美洛昔康注射液(0.1 mg/kg),见图2。

2.6 双光子显微镜观察

目的：

使用双光子显微镜观察小鼠脑内的胶质瘤和血管情况。

步骤：

1.使用徕卡TCS SP8 DIVE共聚焦显微镜进行图像采集。

2.通过小鼠尾静脉注射FITC-dextran以显示脑血管。

3.设置适当的激发和发射波长，以区分不同荧光标记物（TdTomato、FITC-dextran、GL261-CFP）。

4.在麻醉状态下，以尽可能低的激光功率和气体流量进行扫描，以避免光毒性。

3. 统计学分析

通过双光子显微镜获取到的IMS文件,由 Imaris x64 9.7.2软件量化分析。计量资料均以平 均值 ± 标准误差(???? x ± s???? x)描述,采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析,以P  <  0.05表示差异具有显著性。

4. 结果

4.1　PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-基因鉴定

PCR扩增与凝胶电泳结果分析

1.PDGFRβ-Cre基因鉴定：

样品分析：

野生型等位基因：条带大小为272 bp。

突变型等位基因：条带大小约为320 bp。

图3A ~ 3B：

1号、12号样品仅显示一条约320 bp的条带，表明它们为PDGFRβ-Cre纯合突变体（PDGFRβ-Cre-/-）。

2号样品显示两条条带，分别为272 bp和320 bp，表明它为PDGFRβ-Cre野生型与突变型的杂合体（PDGFRβ-Cre+ / +）。

3 ~ 11号样品同样显示两条条带，但具体比例可能因个体而异，表明它们均为PDGFRβ-Cre的杂合体（PDGFRβ-Cre+ /-）。

2.Rosa26-tdTomato基因鉴定：

样品分析：

突变型等位基因：条带大小约200 bp。

野生型等位基因：条带大小约为297 bp。

图3C：

1号、3号、4号样品显示两条条带，分别为200 bp和297 bp，表明它们为Rosa26-tdTomato的杂合体（Rosa26-tdTomato+ /-）。

2号、5号样品仅显示一条约297 bp的条带，表明它们为Rosa26-tdTomato的野生型纯合子（Rosa26-tdTomato-/-），即不携带tdTomato突变等位基因。

4.2　PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-小鼠表型分析

 C57BL/6遗传背景的PDGFRβ + 细胞特异性 携带红色荧光的小鼠与C57BL/6小鼠的外观形态、生长速度、繁殖能力无显著性差异。HE结果显示, PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-小鼠与C57BL/ 6小鼠的脑、肺、心脏、肝、脾和肾等无显著性差异 (图4)。

4.3　PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-小鼠手术颅窗

实验准备：

1.小鼠选择：

选择8至12周龄的PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-转基因小鼠。这种小鼠模型通过Cre/LoxP系统允许在特定细胞（如PDGFRβ+细胞）中诱导表达红色荧光蛋白tdTomato，便于在显微镜下观察和追踪这些细胞。

2.手术颅窗制备：

· 颅骨开窗：

以小鼠头部的前囟（矢状缝与冠状缝的交点）为圆心，使用颅钻小心地磨去直径6mm的颅骨区域，暴露大脑皮层。

· 玻璃圆片覆盖：

在暴露的脑表贴上一个6mm的玻璃圆片（见图5A)，以保护脑组织并减少术后炎症。

· 牙科水泥固定：

围绕玻璃圆片在颅骨表面涂抹牙科水泥(见图5B)，并立即安装固定环，确保固定环与颅骨之间的缝隙被水泥填满，以增强稳固性。

实验过程

1.恢复与观察准备：

手术后，小鼠需要至少4周的时间来恢复，使因手术造成的炎症消退。

2. 麻醉与注射：

使用异氟烷麻醉小鼠后，将其固定在双光子显微镜下。通过尾静脉注射200μL FITC-dextran（一种荧光标记的葡聚糖，可用于观察血管），以增强血管的可视化效果。

3.双光子显微镜图像采集(见图5C、图5D)：

利用双光子显微镜采集活体小鼠大脑中的荧光图像，观察tdTomato+细胞（即PDGFRβ+细胞）的分布和动态变化。

4.4　PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-小鼠模型的活体双光子显微成像

实验准备：

在第-30天，对三只PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ /-小鼠进行了颅窗手术准备。随后，在第-2天、第-1天以及第0天，每天给每只小鼠腹腔注射75 mg/kg的Tamoxifen。从第3天起，开始使用双光子显微镜进行动态的荧光成像跟踪（如图6A所示）。

实验结果：

从第3天到第7天，Tamoxifen诱导的PDGFRβ-Cre系统逐渐激活，导致tdTomato红色荧光蛋白在PDGFRβ+细胞中的表达显著增加（如图6B所示）。这一过程在大约7天后趋于稳定，表明在Tamoxifen的诱导下，所有PDGFRβ+细胞表达红色荧光蛋白所需的代谢期约为7天。

4.5　构建基于PDGFRβ-Cre+ /-:Rosa26-tdTomato+ / 小鼠的胶质瘤模型

细胞系的改造与筛选：

使用CFP（青色荧光蛋白）慢病毒感染GL261细胞，这一步骤使得原本不易追踪的胶质瘤细胞能够发出青蓝色荧光，便于后续实验中的观察和定位。（见图7A）

通过500 μg/mL的G418进行筛选，确保只有成功整合了CFP基因的GL261细胞能够存活并增殖，从而得到稳定的GL261-CFP细胞系。

细胞注射与定位：

将5 × 10³个GL261-CFP细胞缓慢注射到小鼠大脑皮层的特定位置（见图7B）（前囟两侧1 mm，前方2 mm处（见图7C）），这是模拟胶质瘤自然发生位置的关键步骤，有助于观察胶质瘤在体内的生长和侵袭模式。

术后处理与固定：

注射完毕后，使用生理盐水温柔地清洁脑表，以减少感染风险并保护脑组织。

贴上玻璃圆片以保护注射区域，并沿着玻璃圆片涂上牙科水泥以固定玻璃圆片和颅骨，确保后续成像过程中的稳定性。

立刻放置固定环以进一步加固结构，防止术后小鼠活动对实验造成影响。

胶质瘤模型的验证：

通过HE（苏木精-伊红）染色对胶质瘤进行组织学验证，可见多形性胶质瘤细胞、细胞核增大深染以及胞浆嗜酸性染色阳性等特征(见图7D），这些特征表明成功建立了胶质瘤模型。

4.6　胶质瘤内壁细胞及血管形态结构异常

动态追踪：

从第3天开始，通过双光子显微镜对胶质瘤生长进行动态追踪。观察到从第3天到第7天，红色荧光蛋白表达逐渐增加，第7天后趋于稳定。

胶质瘤侵袭与血管变化：

侵袭过程：第7天观察到胶质瘤开始侵袭增殖，第10天形成多发性病灶，第14天占位明显。这一过程展示了胶质瘤在体内的生长和侵袭模式。（见图8A)

血管形态变化：

随着胶质瘤的生长，血管形态发生显著变化。第7天开始，PDGFRβ+壁细胞逐渐游离出血管壁，第14天时游离比例显著增加。同时，血管脉络破碎、新生血管形成，导致血管与游离壁细胞的平均距离先上升后下降。

5.讨论

本研究通过构建壁细胞自发荧光的基因工程小鼠模型，结合双光子显微活体成像技术，实现了胶质瘤、血管及壁细胞在活体水平上的动态变化观察。双光子显微镜以其高分辨率、低光毒性和深组织穿透力，为胶质瘤与壁细胞相互作用的研究提供了高效工具。该模型不仅克服了传统成像技术的局限，还展示了胶质瘤增殖过程中血管紊乱及壁细胞形态变化的细节，为胶质瘤的发病机制、侵袭转移路径及治疗策略的研究开辟了新途径。未来，该模型有望促进胶质瘤治疗药物的研发与疗效评估，为临床治疗提供有力支持。

文章参考：马铖延,杨星九,史旭东,等. 双光子显微镜技术下胶质瘤-壁细胞在体多荧光示踪小鼠模型的建立及应用 [J]. 中国实验动物 学报, 2024, 32(6): 702-711.

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