两种呼吸道感染途径建立豚鼠结核模型的比较

       结核病是致命传染病，结核动物模型对诊防研究至关重要。豚鼠因对结核菌敏感，成为疫苗效果评价优选。其疾病进程、病理变化接近人类，但应用受限于近交系少、饲养难、免疫试剂缺。感染模型方式多样，气溶胶感染因均一、安全，被视为未来方向。

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验动物：24只SPF级雌性哈氏豚鼠，年龄8~10周，体重范围250~300克。

饲养条件：

• 昼夜各半循环照明。
  
• 相对湿度40%~70%。
  
• 温度控制在18~22℃。
  
• 自由进食饮水。

1.1.2 菌株

结核菌标准株

1.1.3 主要试剂与仪器

异氟烷、舒泰、7H10培养基、;OADC增菌液、抗酸染色试剂盒、美天妮匀浆机、肺部液体定量雾化器、小动物呼吸麻醉机

1.2 方法

1.2.1 通过气管内定量气溶胶感染建立豚鼠结核 模型

将12只豚鼠分为A（对照组）、B（低剂量感染组）、C（高剂量感染组）三组，每组4只。分别编号A1-A4、B1-B4、C1-C4。用舒泰麻醉后，A组注射无菌生理盐水，B、C组分别注射不同浓度Erdman株结核菌悬液。在ABSL-3实验室正常饲养，观察2周后解剖，记录豚鼠表现。

1.2.2 滴鼻感染建立豚鼠结核模型

将12只豚鼠分为D（滴鼻对照组）、E（低剂量滴鼻感染组）、F（高剂量滴鼻感染组）三组，每组4只。编号D1-D4、E1-E4、F1-F4。使用小动物麻醉机麻醉豚鼠后，D组滴鼻生理盐水，E、F组分别滴鼻不同浓度Erdman结核菌悬液。在ABSL-3实验室正常饲养，观察2周记录表现，之后解剖豚鼠。

1.2.3 豚鼠组织荷菌量测定 

在ABSL-3实验室负压解剖台上解剖感染豚鼠，取肺、脾、肝组织并拍照记录病变。将组织分割称重后，经稀硫酸和生理盐水处理，研磨成匀浆并稀释。取稀释液涂布于7H10培养基，37℃培养4周，计算各组织器官荷菌量。

1.2.4 组织切片的苏木素-伊红(HE)染色及抗酸 染色

组织器官经福尔马林固定后制成石蜡切片，HE染色后扫描为数字图像进行病理分析。另取切片抗酸染色，封片后扫描保存，统计分析结核杆菌阳性结果。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2统计分析绘图软 件,结果以平均值 ± 标准差(???? x ± s)表示,组间比较 采用单因素方差分析,P  <  0.05表示有统计学 意义。

2. 结果

2.1 豚鼠一般临床表现及大体病理

B、C、E、F组豚鼠与A、D组在一般临床学上无显著差异，但C、F组部分严重感染豚鼠外观不良。解剖显示，A、D组脏器正常，而B、C、E、F组脏器尤其是肺、脾、肝有肉眼可见的病变，包括肺粟粒样结节、纤维化，脾和肝肿大及白色病变。

2.2 豚鼠脏器的组织病理病变

A、D 组 HE 染色表现正常,B、C、E、F 组豚鼠 肺、脾、肝组织HE染色均可见典型结核性病变。

2.2.1 脾和肝组织病变

A、D组健康豚鼠脾结构完整，红髓白髓分明；而B、C、E、F组豚鼠脾因结核感染病变，生发中心受损，伴有炎症浸润和充血出血，白髓与脾小体、红髓界限模糊。A、D组豚鼠肝无异常，但B、C、E、F组豚鼠肝内出现多个大小不一的小肉芽肿和坏死灶。

2.2.2 肺组织病理病变

豚鼠肺部病变分为四阶段：Ⅰ期为炎性细胞浸润；Ⅱ期为小面积实变及不典型结核肉芽肿形成；Ⅲ期为典型结核肉芽肿伴大面积实变；Ⅳ期为全肺大面积实变伴干酪样坏死。B、C、E、F组豚鼠均出现典型结核病变，包括肉芽肿、肺泡壁增厚等，且感染途径和剂量对病理类型和严重程度无显著差异，表明两种感染方式及剂量均可成功制备豚鼠结核模型。

2.3 肺组织抗酸染色结果

通过肺组织切片原位抗酸染色，B、C、E、F组豚鼠肺部病变区能检出结核分枝杆菌，且其分布与病变程度相关。病变初期未检出，随病变加重，结核菌量增多，主要集中于肉芽肿核心区域。

2.4 结核菌在各组织脏器中的分布和复制增殖

感染2周后，B、C、E、F组豚鼠肺中均可分离出结核菌，数量级达达10⁵~10⁶CFU/mL，感染途径和剂量对肺内荷菌量无显著影响。F组豚鼠肺内荷菌量最为均一，B、C组次之，E组差异最大。滴鼻和气溶胶感染在结核菌分布和数量上略有不同，滴鼻组E、F豚鼠脾肝中可检出少量菌，而气溶胶组B、C主要在脾中检出，仅C3豚鼠肝中检出。

3. 讨论

豚鼠模型成功模拟结核病，气溶胶感染相较于滴鼻感染具有模拟自然感染、精确定量且生物安全风险小、更好模拟天然和特异免疫过程等优势。气管内气溶胶感染相比全自动气溶胶发生器，生物安全风险更低。这些优势表明气溶胶途径是制备豚鼠结核病模型的有效方法。

本研究成功建立了滴鼻感染豚鼠急性结核动物模型,以及气溶胶感染豚鼠急性结核模型两种感染途径的病原学传播曲线稍有不同。下一步本团队将继续摸索气溶胶和滴鼻感染的豚鼠模型的菌复制和病变动态变化,以及区分急性结核和潜伏感染的最低感染剂量、致死剂量以及均一模型的最小感染剂量等。另外由于目前缺乏豚鼠相关的免疫学试剂,因而本模型的免疫学指标尚未深入探索,后续将关注相关免疫学试剂的研发,进一步深入结核相关的关键细胞亚型和细胞因子研究,发掘该模型的应用价值,为研究 TB 发病机制、新型疫苗和药物的筛选评价提供研究工具。

参考文献：李新雨,李海凤,王煜,等. 两种呼吸道感染途径建立豚鼠结核模型的比较 [J]. 中国实验动物学报, 2024, 32(6): 733-742.

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