小鼠原位肝移植模型的建立与评价

小鼠原位肝移植模型

       肝脏作为生命基石与免疫调节枢纽，显著提升了肝移植受体的手术耐受力。相较于心脏、肺等异位移植，小鼠原位肝移植模型因高度模拟人类手术，加之其基因组易操作、成本低廉、免疫学监测便捷，成为不可替代的研究工具。自Qian等1991年开创性建立此模型以来，它已深入探索了肝脏的免疫、再生奥秘，并因肝脏的造血功能，为造血系统研究开辟了新径。

一、材料与方法

1. 实验动物

C57BL/6小鼠（供体）与C3H小鼠（受体），均为雄性，年龄介于10至12周之间。

2. 试剂

异氟烷、低分子肝素钠、生理盐水、络合碘、4℃UW威斯康星大学保存液。

A为实验试剂，B为手术显微器械，C为M650型显微操作系统，D为胆道支架、门静脉袖套和下腔静脉袖套(从左至右)

3. 主要实验器械

显微外科手术器械，包括弯头显微镊、持针器、Weldon小型动脉夹，Johns hopkins动脉夹、显微剪刀等；M650型单人双目手术显微镜；10-0无损伤带线缝合针、7-0丝线，可吸收明胶海绵；手术台、拉钩等自制。

4.手术方法

4.1 术前准备：

(1) 门静脉套管制作：选用18至20号规格的留置针进行加工，套管的主体部分直径约为2毫米，手柄长度则根据操作者习惯设定在1毫米或稍长。为了增强套管的稳固性，防止术中打结不紧密或意外滑脱，需在套管上细心切割出1至2个细微凹槽。

(2) 肝上下腔静脉套管制备：与门静脉套管相似，采用16号留置针作为原材料，按照相同的步骤进行精细加工，确保套管符合手术要求。

(3) 胆道支架的定制：选取PE10聚乙烯管，通过反复的物理拉伸方法，将其直径精确缩小至0.3至0.5毫米之间。随后，对管的两端进行楔形切割，确保切口平滑，支架总长度调整至约2毫米，以满足手术需求。

4.2 供体肝脏获取：

小鼠经气体吸入麻醉后，进行标准术前准备与消毒，固定体位。采用U型或上腹部十字切口充分暴露手术视野。术中，通过精细操作游离肝周组织，依次处理肝动脉、胆道及静脉系统。全身肝素化后，以4℃ UW液缓慢灌注肝脏，直至灌洗液清澈，确保灌注充分。随后，逐一离断关键血管与胆管，摘除胆囊，最终完整取下肝脏。取下的肝脏迅速置于4℃ UW液覆盖的培养皿中，并放置于冰上，以维持最佳状态供后续操作。

4.3 供体肝脏修整：

精确安装20G与16G套管至门静脉与下腔静脉，确保方向无误并避免血管扭曲，随后用10-0丝线稳固结扎。门静脉套管就绪后，追加UW液灌注。在肝下下腔静脉处预置7-0活结，肝上腔静脉则预留10-0带针丝线以备缝合。全程操作均在冰上细致进行，确保肝脏质量。

图为小鼠原位肝移植的手术过程　A为休整后的供体肝脏，B为受体肝脏移除前腹腔血管裸化，C为开放后的SHIVC和肝脏，D为手术后的受体腹腔套管情况。

4.4 受体手术：

小鼠麻醉后，备皮消毒并固定，开腹暴露术野，结扎胆管、肝动脉等，分离肝周韧带并牵引SHIVC。补液后，依次阻断并离断IHIVC、PV及SHIVC，移取肝脏。采用外翻吻合SHIVC，袖套法吻合门静脉，开放血管结束无肝期。复温后红润，同法吻合IHIVC，置入胆管支架并固定，还纳肠道，补充生理盐水后缝合关腹。

4.5 术后护理：

术后小鼠被置于37℃恒温环境中，直至其自然苏醒，随后恢复自由饮食与饮水，采取单笼饲养。术后三天内，每12小时通过腹腔注射给予布洛芬（剂量0.1 mg/kg）以缓解疼痛，同时每24小时注射头孢唑林（剂量100 mg/kg）预防感染，无需额外使用免疫抑制剂。

4.6 术后监测：

术后观察小鼠活动情况，存活4天以上判为手术成功。

5. 统计学处理

采用SPSS (16.0版)软件将数据进行统计学处理。计数资料以率(百分比)表示，计量资料以(X±s)表示。

二、结果

1. 预实验

在完成70例小鼠原位肝移植练习中，旨在提升显微外科血管与胆道吻合技巧。初期模型构建时，受体小鼠的死亡主要归因于麻醉并发症、吻合口渗血、血管堵塞、气胸形成、胆瘘导致的腹腔感染，以及门静脉套管的不当操作如扭转等。

2. 移植结果

同系移植220对，成功199对，成功率90.4%。供受体处理时间分别为(40±8.8) min和(75±9.6) min，供肝处理时间(23±4.7) min。失败21例中，原因包括套管扭转、吻合口出血、无肝期过长、胆瘘感染及不明原因，分别导致术后不同时间内的死亡。

三、注意事项

1. 小鼠重量选择

25-30g小鼠最佳，体重过轻胆管细（<25g）、血管短，手术难；过重则脂肪多，易出血，手术难（>35g）。

2、胆管支架制备

避免频繁牵拉导致管腔变窄，影响胆汁流通；同时，支架两端应保持圆润，预防在套管过程中损伤胆管壁。

3、气胸

在进行SHIVC套线时，应先用棉签进行钝性分离，随后用钝镊从左向右下方轻轻分离，确保不误入胸腔。由于小鼠膈肌非常薄弱，若使用暴力牵拉2-0丝线来阻断SHIVC，可能引发气胸甚至心脏骤停的风险。

       4、出血及血栓

小鼠肝脏非常脆弱，操作时必须谨慎避免机械性伤害，以防肝脏表面出血。翻动时应轻柔且避免反复，以减少微血栓形成的风险。推荐顺时针方向进行分离，这样可以最大限度地保护肝脏免受损伤。

       5、套管扭转成角

门静脉及下腔静脉套管时，肝脏脏面朝上浸于冷UW液，借浮力辨血管。肝横轴与文氏钳平行，血管定位精准：脾、幽门静脉对PV套管6点、3点；右、左肾静脉对IHIVC套管9点、3点。注意肝位，套管时明确血管方向。

       6、补液

小鼠的血容量仅1.5～1.8 ml，因此操作时应尽量避免出血，积极止血。无肝期前后补液及术后保温对小鼠术后恢复有重要作用。

       7、无肝期

血流阻断应严格限时，不超过20分钟，以防小鼠遭受过度缺血再灌注损伤，导致体内环境紊乱及酸中毒等严重后果。

       8、SHIVC缝合

小鼠SHIVC管壁脆弱，肝脏娇嫩，手术要求精细操作。推荐连续外翻缝合法，确保吻合口平滑，预防血栓形成。左膈静脉需单独缝扎，并在3点和9点加强缝合以防漏血。注意避免拉线过紧，以免吻合口狭窄。

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