PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR的区别

一、PCR介绍

PCR，1985年由Kary B. Mullis发明，是一种在体外快速扩增DNA的技术。Mullis因此获1993年诺贝尔化学奖。该技术从普通PCR发展到实时荧光定量PCR（qPCR），再到数字PCR（dPCR），每代升级都提高了灵敏度、准确性，并拓宽了应用领域。

二、PCR的基本原理

PCR技术模仿DNA自然复制，通过DNA聚合酶在体外扩增特定DNA片段。其过程包含三个核心环节：高温使DNA变性解开，低温让引物与DNA模板结合（退火），以及适中温度下DNA聚合酶延伸新链。这三个环节循环往复多次（一般25至40次），从而实现目标DNA片段的指数级增长。

高温变性：将反应体系加热至90~95℃，使DNA双链解离成单链。

低温退火：降低温度至50~65℃，使引物与模板DNA的单链互补配对结合。

适温延伸：在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，在适宜的温度（通常为72℃）下，引物沿模板DNA进行延伸，合成新的DNA双链。

三、PCR的分类

1.普通PCR

介绍：普通PCR，作为第一代PCR技术，依赖于琼脂糖凝胶电泳来进行结果的定性判断。

优点：该技术成熟度高，操作流程简便，且成本控制在较低水平。

缺点：它仅限于定性分析，无法精确测量扩增后的DNA数量；同时，在检测低拷贝数的目标基因时，其灵敏度存在局限。

2.实时荧光定量PCR（qPCR）

介绍：qPCR（Real-Time PCR）为第二代PCR技术，通过加入荧光染料监测扩增过程，利用CT值和标准曲线定量分析。

荧光方法：

TaqMan探针法：特异性强、灵敏度高，但成本高，易受影响。

SYBR Green法：价格低、通用性好，但可能产生假阳性。

优点：精确定量；高灵敏度，适合低拷贝基因；检测快速，高通量适用。

缺点：结果受实验条件影响；染料法可能假阳性；探针法成本高。

3.数字PCR(dPCR)

介绍：数字PCR，作为第三代PCR技术，依据泊松分布，将核酸样本分散至众多微反应单元，进行单分子PCR扩增与荧光检测，经统计分析实现绝对定量。

优点概述：灵敏度与精确性极高；实现绝对定量，无需标准曲线；适用于痕量样本及复杂背景下的稀有突变检测。

缺点简述：技术复杂，操作难度大；成本高昂；对设备与实验条件要求严格。

4.逆转录PCR（RT-PCR）

介绍：逆转录PCR是一种特殊的PCR技术，旨在检测基因表达水平、RNA病毒量及克隆cDNA序列。该技术先将RNA逆转录成cDNA，随后以cDNA为模板进行PCR扩增。

优点简述：高灵敏度，适合低丰度RNA检测；应用广泛，满足多种研究需求。

缺点概述：操作步骤繁琐，易污染；反转录效率影响最终结果；对RNA质量及完整性有严格要求。

5.实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）

介绍：RT-qPCR是qPCR和RT-PCR的组合技术。它首先进行RNA的反转录，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。这种方法结合了RT-PCR的灵敏度和qPCR的精确性，用于定量检测细胞中基因表达水平或RNA病毒的含量。

优点：能实现精确的定量分析；灵敏度高，适用于低丰度RNA的检测；检测速度快，适用于高通量筛选。

缺点：操作步骤较多，可能增加污染风险；反转录效率可能影响结果；成本相对较高。

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