急性肺损伤模型

一、前言

研究呼吸系统疾病时，动物模型至关重要。急性肺损伤(ALI)病理生理复杂，模拟其变化是研究治疗的基础。脂多糖(LPS)能诱发小鼠急性肺炎，常用制作ALI小鼠模型。腹腔注射创伤小但靶向性差，气管给药有多种方式。其中，经口气管插管无创、快速、成模稳定，是建造小鼠ALI模型的有效方法。

二、小鼠肺部图

三、器械材料

(1)仪器:显微镜，血生化仪，酶标仪，吸入麻醉系统。

(2)器械材料:眼科镊，1mL 注射器，18 G平头针头，100 μL 平头微量注射器LED 体外透照灯，小鼠悬挂固定器(图47.3)，异氟烷，脂多糖(用生理盐水配制成0.5 mg/mL 的溶液)。

四、手术流程

(1)按照小鼠体重，准备好装有脂多糖溶液的 100μL 平头微量注射器，吸入剂量为 1mL/kg。先吸入 20 μL 空气，再吸入脂多糖溶液，针头向下放置待用。

(2)小鼠以 3%异氟烷吸入麻醉

(3)达到较深度麻醉后，迅速将小鼠从麻醉箱中取出，将上门齿固定在小鼠悬挂固定器上，并将光源对准小鼠颈部。

(4)用眼科镊拉出舌头，探视咽喉部，在光源照射下小鼠气管开口处为一亮点，且随着小鼠呼吸会横向开合，若观察不到亮点可调整视线角度，直至看到开合的气管开口便可进行下一步操作。

(5)经口将100μL平头微量注射器针头插入气管，针顶端停止在透光亮点处，快速注入注射器里的全部脂多糖溶液和空气。

(6)从固定器上摘下小鼠，保持竖直状态，轻轻左右摇晃20s，使液体从气管、支气管深入肺部，此时小鼠苏醒。

(7)转入饲养笼内饲养

五、模型评估

1.细胞计数

(1)分离颈前组织，暴露气管。

(2)小鼠安乐死后，立即经口插入 18 G平头针头注射器至气管，距离门齿2cm 处固定。

(3)用37℃的3mLPBS缓冲液分3次全肺灌洗，每次冲洗3遍并回收液体计数细胞。诱导后，小鼠BALF中白细胞数量先降后升，4小时达峰值，之后逐渐下降。

2.细胞因子检测

ALI由非心源性因素引发，特征为肺细胞损伤、炎症及中性粒细胞积聚。ELISA检测BALF中IL-6和TNF-α显示，两者水平诱导后2小时达峰值，随后波动变化。

3. 直接观察

肉眼观察可见诱导后小鼠出现较为明显的肺水肿及肺淤血，正常对照组给予等量生理盐水灌注无明显变化。

4.组织病理学评价

于诱导后不同时间点安乐死小鼠，取肺组织做大体拍照，并做病理切片后行 H-E 染色，观察肺损伤情况。结果发现模型组可见肺泡内出血、炎症浸润、肺组织水肿

5.肺湿干比

术后6小时安乐死小鼠，取肺组织称重得肺湿重，烘干后称重得肺干重，计算湿干比。急性肺损伤会导致湿重和湿干比增加。

6.肺通透性检测

肺损伤给药6小时后，注射伊文思蓝染料。30分钟后取血清和双肺，肺组织匀浆后以甲酰胺孵育，离心取上清液，测量EB浓度并校正血清含量。

六、讨论

1.准确气管插管这一关键操作技术需要注意的事项

(1)用微量注射器吸取诱导药物前可吸入20L空气，药物注射完成后继续推注空气，使诱导药物更加深入肺组织，保证诱导效果。

(2)务必在亮点处插入微量注射器，插入后可明显感触到气管的环状结构，如插到气管外，需更换动物进行诱导。

(3)注入诱导液体后，将小鼠以竖直状态左右轻摇 20s,目的是避免诱导液体随呼吸排出气管，影响诱导效果

2.容易发生的错误以及预防和挽救措施

(1)用眼科镊夹舌头时注意用力不要太大，避免造成舌面破损出血，影响细胞计数和细胞因子检测。

(2)采用吸入麻醉，小鼠在离开麻醉气体后会很快苏醒，故诱导操作务必迅速，不宜超过 30s。为避免苏醒后重新麻醉，必须熟练操作。

参考书籍：《Perry小鼠实验手术造模》

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