小动物活体成像

一、介绍

       小动物活体成像主要采用生物发光与荧光技术，前者利用荧光素酶基因标记，后者用荧光报告基团（如GFP、RFP等）标记。该技术通过高灵敏度光学仪器，让研究人员非侵入性地追踪活体动物体内细胞、基因活动及疾病过程，如肿瘤生长、感染进程等。相比传统宰杀法，此技术能连续观测同一实验对象，数据更真实可靠，且对肿瘤微小转移检测极为灵敏，安全无放射性。其简便操作、直观结果和高灵敏度，使其迅速应用于生命科学、医学及药物研发领域。

二、技术原理

1. 标记原理

哺乳动物生物发光通过将Fluc基因整合到细胞DNA，表达荧光素酶，并注射荧光素底物，在活细胞内催化发光，强度与细胞数相关。细菌则依靠lux操纵子内基因自我发光，无需外源底物。细胞可通过基因插入染色体实现荧光素酶标记，常用细胞株已市售。将标记细胞注入小鼠，注射荧光素后，发光可持续30-45分钟。尽管单次发光肉眼难辨，但利用高灵敏度CCD相机及成像系统，可观测并记录这些光子。

2. 光学原理

光在哺乳动物体内传播时会因细胞和组织特性而散射、吸收及折射，尤其在红光波段，光能有效穿透组织。细胞数量与检测到的发光强度在相同深度下呈良好线性关系。可见光体内成像技术正是基于这一原理，利用光穿透组织并被仪器量化检测，从而间接反映体内细胞数量。

3. 实验过程

通过分子克隆和单克隆筛选，荧光素酶基因被稳定整合至目标细胞内，培育出持续表达该酶的细胞株。成像时，小鼠麻醉后置于暗箱，先拍背景图，再在无光环境下捕捉小鼠体内发光，叠加背景图定位光源。软件自动分析图像，选定区域后计算光子数，提供实验数据，并具备高效的数据处理和保存功能，加速实验进程。

4. 荧光成像功能

荧光发光由激发光引发，常用GFP、DsRed等标记，操作简便且经济。红光较蓝绿光体内穿透性更佳，近红外荧光尤适于生理观测。虽荧光信号强，但背景噪音大，信噪比低，影响灵敏度，多用于体外及特定领域如植物分子学和小分子代谢。生物发光则因低噪音而常用于动物体内成像。两者各有优劣，可根据研究需求选择。近年来，双重标记技术结合荧光成像的体外便利与生物发光的体内优势，成为研究新趋势。

三、技术应用

通过活体动物体内成像系统，可以观测到疾病或癌症的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并可用于病毒学研究、构建转基因动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。具体应用如下：

1. 标记细胞

（1）癌症研究：生物发光成像技术无创监测肿瘤生长、转移及治疗效果，助力抗癌药物研发。

（2）免疫与干细胞：该技术标记细胞，连续追踪造血干细胞及淋巴细胞，揭示免疫应答及治疗的细胞机制，节约资源。

（3）细胞凋亡：融合蛋白技术结合荧光素酶，细胞凋亡时发光，直观监测活体动物体内凋亡过程。

2. 标记病毒

（1）病毒侵染：荧光素酶标记病毒，清晰观测其侵染路径及神经系统入侵过程，已广泛应用于多种病毒研究。

（2）基因治疗：荧光素酶作为报告基因，助力非侵入式监测目的基因在动物体内的表达情况，评估基因治疗效果，并可用于观察脂质体载体的基因运输情况。

3. 标记细菌

（1）细菌侵染研究
可以用标记好的革兰氏阳性和阴性细菌侵染活体动物, 观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。

（2）抗生素药物
利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，医药公司和研究机构可用这种成像技术进行药物筛选和临床前动物实验研究。

4. 基因表达和蛋白质相互作用

（1）组织特异性表达：利用双荧光素酶系统，以renilla为内参，firefly反映组织特异性启动子活性，精确评估基因表达。

（2）蛋白质互作：荧光素酶片段标记蛋白，互作则发光，揭示体内蛋白质相互作用及信号传导。

（3）RNA阻断：生物发光变化验证siRNA在体内特异性基因沉默效果。

5. 转基因动物模型

（1）基因表达：荧光素酶标记目的基因启动子，创建转基因动物模型，通过生物发光追踪基因表达，研究基因时空表达及药物诱导等。

（2）疾病模型：荧光素酶标记靶基因、细胞等，构建疾病模型，实时监测基因表达及药物反应，评估药物毒性与效用。

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