细胞冻存方法

       细胞冻存技术是一项关键性的实验手段，旨在通过低温保存来维护细胞的完整性与活性，确保它们在未来某个时间点能够被成功复苏并继续用于多种科学研究和应用之中。这项技术对于珍稀细胞资源的长期保存、构建稳定的细胞库以及深入探索细胞生物学特性等方面，均展现出不可或缺的价值与重要性。

一、实验步骤

● 在准备细胞冻存液时，建议根据个人的实验需求或团队习惯来设定其配置比例。若面临细胞样本量有限或使用者较少的情况，推荐采取小批量配置的策略，以避免浪费。完成配置后，鉴于DMSO（二甲基亚砜）对光线的敏感性，务必采取严格的避光措施来妥善存储冻存液，以确保其质量和稳定性。

● 细胞冻存前需确保密度≥90%，镜检达标后，弃旧培养基。接着，沿皿缘缓缓注入1ml温PBS，轻洗细胞表面，以去除杂质，为冻存流程奠定清洁基础。

● 弃掉PBS缓冲液，加入胰酶消化细胞，消化时间根据细胞类型决定。

● 消化到时间后，加入二倍胰酶体积的培养基终止消化，用移液器将细胞全部吹下，转移至离心管内。

● 离心机常温800rpm，离心5min。

● 弃上清，加入1ml配置好的冻存液，用移液器轻轻吹打10-15次混匀。

● 冻存管标记好相应信息，包括细胞名称、代数、冻存时间、操作者姓名等，将上述混悬液全部转移至冻存管内，拧紧冻存管管口，放入程序降温盒内。

● 将程序降温盒放入-80℃冰箱内，36h后可从程序降温盒内拿出细胞放在细胞冻存架上保存。

二、常见问题

1.细胞冻存管具体存放方式、温度、时间等由实验室条件决定
2. 关于冻存液的配置，该实验所用配方为培养基：血清：DMSO =7：2：1，整个实验过程中冻存的细胞复苏状态良好。

三、注意事项

1. 在冻存管上标记信息时使用一支质量较好的马克笔，保证在后期进行细胞复苏时信息不会被水或酒精洗掉。

2. 细胞冻存时应保证细胞状良好，无污染。

3. 细胞冻存需遵循“慢冻”原则，加入冻存管后应精细操作，确保缓降温，防结晶损伤细胞。

4. DMSO作为细胞保护剂，深冷时防冰晶护细胞，是冻存液关键成分。虽血清比例可调，但针对敏感或珍贵的细胞，如原代细胞，建议提升血清至50%-90%区间，以增强细胞存活率。

5. 细胞冻存后再进行复苏时，细胞数量不可避免会减少，因此，在冻存前，细胞量要足够多，密度≥90%。

6. 细胞混悬液加入冻存管后，不宜在常温放置过久，因此应先将细胞冻存盒放入冰箱，再进行后续相关实验。

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