提高脊髓组织冰冻切片质量的方法

一、取材

常见大小鼠的脊髓取材方法有两种：

“剪裁”法通过剪断椎板获取整条脊髓，虽全面但易致损伤与污染，尤其面对大鼠厚椎板挑战。而“冲注”法利用水流压力快速冲出脊髓，对胸段以下尤为高效且结构完整，但需防被膜缠绕破坏。对于颈段脊髓，因其狭窄管径与长脊髓特性，“冲注”法可能因水压不足而失效。因此，依据所需脊髓段的不同，灵活选择“剪裁”或“冲注”法，以确保取材效率与质量。

同时获取脊髓与背根神经节时，应优先取脊髓以保其完整，随后谨慎操作取出DRG，防牵拉损伤脊髓。DRG位于椎间孔，夹取时需细致，以免破坏胞体。针对DRG远端粗壮神经纤维，可借助止血钳轻夹，连带胞体一并抽出，保留适量神经纤维，便于后续实验处理，确保整体组织无裂痕，为切片制备奠定良好基础。

二、固定

1. 常用的固定方法是采用4℃下4%浓度的多聚甲醛溶液，浓度增高则固定时间需延长，虽增强固定效果但也会加剧组织收缩与损伤。

2. 脊髓组织固定时间的增加会导致抗原表达减弱，特别在脊髓前角区域更为明显。

3. 若在取材过程中PFA灌注不充分，可额外将脊髓组织浸泡于PFA中4至6小时进行补充固定，但务必控制在24小时内以防结晶生成，影响后续染色质量。

4. 为确保固定效果，固定液的量需充足，以保证全面均匀地固定组织。

三、脱水

脊髓富含水分，为防止冰冻切片时冰晶损伤，采用蔗糖梯度脱水法，依次用15%、20%、30%蔗糖溶液处理。此过程称沉糖，初时脊髓浮于液面，随后蔗糖吸收水分，脊髓密度增，浮力减，最终沉入管底，标志当前浓度脱水完成。此时可换更高浓度蔗糖续脱，确保脊髓逐步脱水，保护结构完整性，为切片做准备。

四、包埋

在处理脊髓与DRG前，需吸除蔗糖溶液残留，随后使用OCT包埋剂进行固定。根据动物体型选择适宜包埋盒底膜，以精确控制包埋剂量。包埋DRG时，先在底膜上涂薄层OCT，稍凝后放置DRG，再覆盖剩余包埋剂，确保切片时DRG排列整齐，利于染色和数据统计。速冻环节，可利用干冰、液氮或高效冰冻切片机速冻台，如瑞沃德机型，其速冻台达-42℃，并配-60℃快冷点，迅速跨越冰点，显著减少冰晶形成，保护组织完整性。

五、切片

脊髓与DRG切片最佳温域为-15至-18℃，双制冷切片机能精准控温，确保最佳切片质量。实际最佳温度因环境、设备而异。切片厚度依实验动物及染色需求调整，小鼠脊髓约10-30μm，DRG约8-20μm，具体厚度可参考权威文献。切片卷曲时，可削减多余包埋剂，减少皱褶，提升切片平整度。

六、贴片与漂片

针对脊髓与DRG这类小巧组织，贴片因其不易起泡或皱褶，常用于室温玻片直接粘附，维持组织完整，便于后续简易染色但效率较低。DRG尤适合此法因其体积微小。脊髓则另有漂片法，通过镊子夹取切片入PBS，适用于免疫组化等，提高染色效率但操作难度与抗体消耗随之增加，且可能遇组织破损、裱片难题，要求操作者技能精湛。

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