精原干细胞（spermatogonia stem cells, SSCs）的分离与培养-技术

1. 精原干细胞介绍

精原干细胞（SSCs）是睾丸中最原始的“精子”，通过自我更新（即增殖，主要在A型精子）和分化和变形成为成熟的子精子，通过精卵结合形成合子（zygote）将遗传信息传递给下一代，在维持高产精子发生方面起着至关重要的作用。因此，利用SSCs研究雄性配子具有重要意义。

如下图所示，要准确分离和足量的SSCs选择合适时期的小鼠（mouse）是决定能否成功分离到或足量的SSCs的前提。根据以前的报道，SSCs主要在出生后第三天，新生小鼠睾丸曲细精管中存在大量（peak）的SSCs，不过一般我们在实践中会选择p4.5的小鼠进行SSCs的分离、培养、鉴定以及后续实验。

2. 实践操作

1.准备工作

1.1 器材灭菌

手术钳，剪刀，镊子，手术刀柄，吸水纸，超纯水，枪头、显微镜、恒温水浴锅、超净台等。

1.2 试剂准备

完全培养基（DMEM+5% FBS+ 2X双抗（青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml）差贴使用<大部分干细胞贴壁性差甚至没有>；DMEM+1% FBS+1X双抗，培养使用）；胶原酶Ⅳ（2mg/ml，使用DMEM配制），DNase（7mg/ml，PBS配制）。

2．采样与原代细胞分离

（一） SSCs分离

1. 采集完睾丸样品置于3X 双抗PBS 采样罐中（采样罐与冰袋一起放置于采样盒中），带回实验室置于4℃冰箱中（短暂放置，这是外出采样才这样处理）；

2. 取出睾丸样品，使用适量3X 双抗PBS清洗组织三次，每次5分钟，然后转移至含有75%酒精的离心管中，杀菌过程中需要不断摇晃，杀菌3分钟即可（切记不能用乙醇作用时间太久，因为生殖类细胞特别容易遭受到乙醇带来的损伤），然后转移至使用3X 双抗PBS再次作用3次，每次5分钟；

3. 将睾丸组织转移至大培养皿中，在超净台中使用剪刀将白膜剥离（轻轻一扯开能很明显的区分睾丸白膜和曲细精管）。

4. 将获得曲细精管转移至3X 双抗PBS中漂洗一次，然后转移至一个新的大皿中，加入少量3X 双抗PBS，剥离多余的组织；

5. 获得曲细精管使用3X 双抗PBS漂洗依稀，转移至一个新皿中，使用眼科手术钳将组织剪至1mm3左右，然后将这些组织转移至50ml离心管中，50g离心2min，吸弃上清，该步骤重复一次；

6. 加入配制好的胶原酶Ⅳ，封口胶封好管口，放入37℃摇床作用20min，消化期间，要拿出来手摇晃，避免消化不均；

7. 将上述消化后的组织，使用80g 离心2min，加入3X 双抗PBS重悬，将组织块沉降后，收集含有曲细精管上液体；

（备注：该步骤可选择加入3-5倍体积的血细胞裂解液，作用2-3min，80g离心2min）

8. 将上述收集的曲细精管液体，使用80g 2min，收集沉淀，加入适量0.25%胰酶，放在37℃水浴锅中震荡消化消化约每3分钟，即可进行镜检，以便控制消化时间，保证细胞活率；

9. 待大部分曲细精管分散成单个细胞后，加入适量血清（或等体积）终止胰酶的消化作用，收集上清，将DNase加入到沉淀中并重悬，然后使用40μm（400目）细胞筛过滤细胞；

10. 将获得的过滤液（含有细胞），450g 作用5min，弃上清，使用1-5ml完全培养基重悬，细胞计数；

11. 每2-3 *107细胞接种于10cm培养皿中，然后加入8-10ml完全培养基，差异化贴壁3次（1h-2h-过夜）（最先贴下去的是支持细胞-少量的管周肌样细胞-极极少量的间质细胞）；

12. 收集差异化贴壁过夜后的细胞，450g 作用5min，弃上清，加入1ml培养基重悬沉淀，然后细胞计数接种（1.5*105/6 well 或6*104/12 well）

3. SSCs传代

1. 原代精原干细胞每2-3d换一次培养基，7d左右进行一次传代；

2. 将培养基吸弃，加入预热0.05%胰酶（可以先用低浓度消化），放入培养箱（37℃，5% CO2）中消化1-2 min（消化过程中需要不断观察，避免消化过度）；

3. 加入等体积的完全培养基，终止胰酶的消化，轻轻吹打培养皿，制备细胞悬液；300g，离心5min；

4.将上清吸弃，获得细胞沉淀并重悬，调整细胞密度，将细胞悬液种至含有饲养层（基质胶）包被的培养皿中，于培养箱中培养。

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