三种早发性卵巢功能不全小鼠造模方法的比较研究

目的：对比分析早发性卵巢功能不全(POI)小鼠模型三种常用造模方法的差异,探索符合POI临 床特征的造模方法。

1.材料

1.1 实验动物

种类与数量：

SPF级雌性ICR小鼠100只

年龄与体重：

8周龄，体重(28±3)g

饲养环境：

屏障动物实验设施

饲养条件：

分笼饲养，室温(20±4)℃，相对湿度60%~70%，光照和黑暗12小时更替，自由进食及饮水

1.2 试剂

雷公藤多苷片、二氧化乙烯环己烯(VCD)、芝麻油、D(+)-半乳糖、ELISA试剂盒：包括血清促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)的ELISA试剂盒

1.3 仪器

常规实验室仪器：实验中所涉及的仪器均为实验室常规配置，具体未详述但满足实验需求。

2. 方法

2.1 动物分组

·  筛选与分组：

适应性喂养3天后，通过连续10天的阴道脱落细胞学检测筛选出96只有规律动情周期的健康雌性小鼠，并随机分为对照组、雷公藤多苷片组（TG组）、VCD组和半乳糖组（D-gal组），每组24只。

·  实验设计：

干预当天设为0d，之后在第16、46和76天分别处死各组8只小鼠，设为各组的I、II和III亚组，进行后续分析。

2.2 POI模型的建立

·  雷公藤多苷片组（TG组）：

以50mg/(kg·d)的雷公藤多苷片混悬液灌胃，连续15天。

·  VCD组：

以160 mg/(kg·d)的VCD溶液腹腔注射，连续15天。

·  半乳糖组（D-gal组）：

以500 mg/(kg·d)的半乳糖溶液颈背部皮下注射，连续75天。

2.3 观测指标

·  造模前后一般情况观察：

记录动物皮毛、活动、进食、大小便和体重等变化，记录死亡情况。

·  动情周期观察：

从干预日开始，各组小鼠每日早晨8:00定时进行阴道细胞学采样，以评估其动情周期变化。

具体操作步骤为：

使用浸有0.9%生理盐水的细棉签，在小鼠阴道内轻柔旋转一圈，随后将棉签在载玻片上轻轻滚动，确保阴道分泌物均匀涂布。之后，利用光学显微镜直接观察载玻片上的细胞形态，以此判断小鼠所处的动情周期阶段。

观察标准阐述如下：

1.动情前期：

此阶段特征为椭圆形有核上皮细胞占据优势，同时可观察到少量角化细胞和白细胞的存在。

2.动情期：

此时，视野中主要为片状无核角化上皮细胞，它们占据了绝大多数，偶尔可见少量有核上皮细胞和白细胞夹杂其间。

3.动情后期：

该阶段表现为白细胞、片状角化上皮细胞以及有核上皮细胞的混合存在，且三者的比例相对均衡，无明显差异。

4.动情间期：

此期以大量白细胞为主，并伴有少量粘液的出现，标志着动情周期的间歇阶段。

·  血清性激素水平：

通过ELISA法测定血清中FSH、LH、E2和AMH的水平。

·  子宫、卵巢指数测定：

计算卵巢指数和子宫指数，评估卵巢和子宫的重量变化。

·  卵巢、子宫组织学观察：

通过石蜡切片与HE染色，观察卵巢中各级卵泡和黄体的数量，以及子宫内膜和子宫肌壁的厚度。

3. 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。 计量资 料以平均值±标准差(???? x ±s)表示,用单因素方差分析 各组间的比较,以α=0.05的标准,P<0.05为差异有统计学意义

4. 结果

4.1一般情况观察

4.1.1小鼠反应：

各造模组小鼠在干预期间均出现活动减少、摄食减少、皮毛光泽度下降等变化，但体重未明显下降。

4.1.2恢复情况：

干预结束后，雷公藤组小鼠的活动和摄食逐渐恢复，皮毛光泽度在第46天恢复正常；VCD组小鼠皮毛光泽度仍较差。对照组小鼠无明显变化。

4.2 小鼠动情周期变化

4.2.1对照组：

有规律的动情周期，约6~7天一次。

4.2.2干预组：

与对照组的比较结果见图1。

4.3 血清性激素水平变化

4.3.1 E2变化：

· 第16天：

各组E2值较对照组均显著下降（P<0.01）。

· 第46天：

雷公藤组和VCD组E2值仍明显低于对照组（P<0.05）。

· 第76天：

雷公藤组E2值仍降低（P<0.05），VCD组E2值持续降低并有显著差异（P<0.05）。

4.3.2 AMH变化：

· 雷公藤组和VCD组在第16天和第46天均显著下降。

· VCD组第76天AMH值仍较低（P<0.05）。

· 雷公藤组第76天AMH值较第16天显著升高（P<0.01）。

4.3.3 FSH和LH变化：

· VCD组FSH值及FSH/LH比值升高，有显著性差异。

（结果见图二）

4.4 卵巢、子宫湿重指数

4.4.1 体重变化：

雷公藤组小鼠体重在第16天明显减轻。

4.4.2 卵巢湿重和指数：

· 第16天：

VCD组卵巢湿重和指数显著减少。

· 第46天：

半乳糖组卵巢湿重和指数显著减少。

· 第76天：

各组卵巢指数无显著差异。

· 子宫指数：

各组子宫指数与同期对照组相比无显著差异。

（结果见表一）

4.5 卵巢与子宫组织结构变化

4.5.1 卵泡计数及子宫厚度：

· 第16天：

雷公藤组发育中卵泡数、成熟卵泡数、子宫内膜厚度减少；VCD组子宫肌壁厚度减小；半乳糖组子宫内膜厚度减小。

· 第46天：

各组发育中卵泡数和黄体数均显著减少。

· 第76天：

VCD组成熟卵泡数、子宫内膜厚度、子宫肌壁厚度均明显减小；半乳糖组子宫内膜厚度减小。

（结果见图三）

4.5.2 形态学观察：

· 对照组：

卵巢体积大，各阶段卵泡和黄体相间分布，子宫内膜正常。

· 雷公藤组：

第16天和第46天卵泡及黄体比例下降，子宫内膜变薄，腺体萎缩，但第76天有所恢复。

· VCD组：

卵泡和黄体比例明显下降，子宫内膜和子宫肌壁变薄，随时间加重。

· 半乳糖组：

卵泡和黄体比例逐渐下降，子宫内膜厚度变薄。

（结果见图4、图5）

5、讨论

本研究对比了雷公藤多苷片、半乳糖和VCD溶液三种方法制备POI动物模型的效果。雷公藤多苷片虽能短期内造成卵巢功能减退，但停药后有自然修复现象，影响药效学研究的准确性。半乳糖模型造模时间长且成模率不高。相比之下，VCD溶液腹腔注射法致病过程与人类相似，病理结果一致，且未观察到自然修复，能稳定模拟POI病理过程。因此，VCD造模法最为优选，适合用于POI发病机理和药物研发的动物模型。

参考文献：苏先芝,刘一斐,孔文娟,等. 三种早发性卵巢功能不全小鼠造模方法的比较研究[J].中国实验动物学报,2019,27(6):725-732.

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