吲哚⁃３⁃丙酸对大鼠急性脊髓损伤的神经保护作用及机制研究

目的：探讨补骨脂素对ＩＩ型胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎的作用并初步探讨其作用的分子机制。

1.材料

1.1实验动物

种类与数量：105只SPF级健康雌性大鼠

年龄与体重：7周龄，体重180～200g

饲养条件：

光照周期：12小时光照与12小时黑暗交替

自由获取高压消毒灭菌水和固态食物

环境：安静、无噪音、整洁干净，温度（20±2）℃，湿度60%±5%

1.2主要试剂与仪器

关键试剂：

IPA、CGRP抗体、GFAP抗体、Caspase3抗体、IL-1β抗体、Necab2抗体、GAP43抗体。

关键仪器：

荧光显微镜：用于观察细胞或组织中的荧光标记物。

垂直凝胶电泳仪：用于分离、鉴定和纯化生物大分子。

低温高速离心机：用于快速、高效地分离和纯化生物样品中的组分。

2.方法

分组情况：105只SD大鼠随机分为3组：假手术组、生理盐水组和吲哚-3-丙酸组，每组35只。

饲养条件：大鼠体重均匀、单独鼠笼饲养、环境基本相同。

遵循原则：实验操作处置符合国家科技主管部门制定的实验动物护理和使用指导意见。

2.2 造模及给药 

麻醉与体位：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，俯卧位固定在手术台上。

手术操作：暴露胸9-10节段脊髓，对生理盐水组和吲哚-3-丙酸组进行脊髓钝挫伤，假手术组仅暴露脊髓不实施损伤。

术后护理：加热垫上苏醒恢复，膀胱护理至自主排尿，术后1周内注射青霉素预防感染。

给药：吲哚-3-丙酸组按25 mg/kg剂量腹腔注射IPA，生理盐水组注射等量0.9% NaCl溶液，每天1次。

2.3 运动及感觉功能评价

评估方法：BBB运动功能评分、斜板实验、甩尾实验。

时间点：术后第1、3天、1周、2周、3周、4周。

评分标准：BBB评分0-21分，斜板实验记录最大停留角度，甩尾实验记录甩尾反应时间。

2.4 免疫荧光染色观察

取材与处理：术后各时间点取5只大鼠，灌注生理盐水和多聚甲醛，收集胸9-10节段神经组织进行石蜡切片。

染色步骤：滴加特异性蛋白标记抗体（如CGRP、GFAP等），荧光二抗孵育，荧光显微镜下观察计数。

2.5 免疫蛋白印迹检测

取材与处理：术后2周取各组5只大鼠胸9-10段脊髓组织，研磨匀浆后离心取上清液。

检测方法：SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜，滴加特异性抗体（如CGRP、GFAP、Caspase3、IL-1β等），生物素化二抗孵育，ABC试剂显色，测定目的蛋白/β-actin的吸光度值。

3.结果

3.１　运动功能评价

　斜板实验与ＢＢＢ评分结果表明，从术后第１周 到术后第４周ＩＰＡ组的两种运动功能测试结果均明 显高于生理盐水组（Ｐ ＜ ０．０５）（见图１）

3.2感觉功能评价

　 甩尾实验检测结果表明，从术后第３天起ＩＰＡ 组潜伏期明显高于生理盐水组，且到术后第２周 ＩＰＡ 组潜伏期基本恢复正常（Ｐ ＜ ０．０５）（见图２）。

3.3感觉功能评价　

CGRP与Syn阳性细胞变化：

假手术组：观察到大量CGRP和Syn阳性细胞，这表明在正常或未受手术影响的条件下，这些神经递质或突触相关蛋白的表达是正常的。

术后生理盐水组和IPA组：术后初期，CGRP和Syn阳性细胞均显著减少，这可能反映了手术对神经元的直接损伤或应激反应导致的表达下调。然而，到术后第2周，两组中的CGRP和Syn阳性细胞均开始增多并达到高峰，表明神经元正在逐渐恢复或适应。特别地，IPA组（可能代表某种药物或干预治疗组）的CGRP和Syn表达水平显著高于生理盐水组，提示该干预可能促进了神经元的恢复或增强了神经递质/蛋白的表达。

GFAP阳性细胞变化：

生理盐水组和IPA组：GFAP是星形胶质细胞的标志物，其表达随时间的延长而逐渐增多，到术后第2周达到高峰，之后有所下降。这表明星形胶质细胞在手术后的反应是增殖和活化，以响应神经元的损伤或应激。然而，IPA组的GFAP表达水平显著低于生理盐水组，这可能意味着IPA干预在某种程度上抑制了星形胶质细胞的过度活化或增殖，有利于减少炎症反应和神经元的进一步损伤。

Caspase3阳性细胞变化：

术后第1天：IPA组和生理盐水组均出现大量Caspase3阳性细胞，Caspase3是细胞凋亡的关键执行酶，其表达增加表明存在大量的细胞凋亡。

随后变化：两组的Caspase3表达均逐渐减少，但IPA组的减少更为显著。（见图三）

3.4免疫荧光双标观察　

 IPA组发现脊髓损伤后第2周CGRPGAP43明显共表达,CGRP与Necab2在邻近细胞呈现互补表达(见图4)。

3.5 Western Blot 检测

　免疫印记结果显示，术后第2周IPA组的CGRP,Syn表达明显高于生理盐水组(P<0.05),术后第2周GFAP、Caspase3、IL-1β 表达明显低于生理盐水组(P<0.05)(见图5)。

4.讨论

大剂量IPA在脊髓损伤后展现显著疗效，通过PXR/ACBP与MTR1/PGC1α途径促进神经细胞增殖、分化及线粒体稳定，增强CGRP、Syn表达，促进神经突触发育。IPA还平衡钙离子，减少炎症、凋亡，抑制神经胶质瘢痕，机制涉及抗炎细胞因子释放、A1型星形胶质细胞活化抑制及脂质过氧化减少。这些作用共同促进脊髓损伤后神经功能恢复。然而，IPA治疗急性脊髓损伤尚处实验阶段，需深入探索蛋白协同作用及临床应用潜力，以期早日造福患者。

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