NEPA 21在脑神经疾病动物模型构建中的应用

婴儿癫痫综合征大鼠模型再现临床特征

       Dravet综合征，一种婴儿期发病的癫痫性脑神经疾病，由SCN1A基因突变引发，导致神经元兴奋性失衡。当前，科研人员正致力于构建动物模型和研发基因治疗方案，以期恢复E/I比率，治疗该疾病。然而，现有模型的长期疗效和安全性尚待研究。大鼠作为癫痫研究的可靠模型，备受科学家青睐。近期，中科院深圳先进技术研究院王虹课题组利用输卵管电转染基因编辑技术，成功构建Scn1a基因突变大鼠模型，该模型高度模拟DS患者的临床症状，且能存活至成年，为疾病进展跟踪、治疗评估和基因治疗方案开发提供了有效的临床前模型。

一、研究结果

      在本次实验中，研究人员采用了创新的方法，将RNP复合物注射入孕鼠的输卵管壶腹部，并利用NEPA 21电转染系统（由NEPA GENE公司提供）对受精卵实施了体内电转染操作。经过两次电转染手术后，共有22只幼鼠存活，其中12只幼鼠的Scn1a基因成功实现了敲除（KO），并且另一个等位基因也发生了突变。

（基于i-GONAD 技术生成Scn1a+/−大鼠）

通过繁育杂合子Scn1a+/−大鼠，我们获得了野生型（WT）、杂合子Scn1a+/−以及纯合子Scn1a−/−（KO）三种基因型的大鼠。随后，利用Mantel-Cox检验和原位杂交等先进技术，我们对这些大鼠脑内的Scn1a基因及其mRNA水平进行了测定。结果显示，与WT大鼠相比，Scn1a+/−大鼠的大脑区域（涵盖皮质、海马和丘脑）中Scn1a基因的表达显著降低，且mRNA水平的减少进一步证实Scn1a+/−大鼠可作为模拟Dravet综合征单倍体功能不全的有效模型。

（Scn1a突变大鼠的基因、mRNA、发育及行为检测）

       鉴于退行性椎体滑移（在本文中特指Dravet综合征）患者常在出生后一年内遭遇高热引发的癫痫发作，研究者决定以幼鼠为研究对象，评估它们对高温诱导癫痫发作的敏感性。值得注意的是，在实验中，所有野生型（WT）大鼠均未出现癫痫发作，而所有杂合子Scn1a+/−大鼠均遭受了严重癫痫发作，显示出对热致癫痫发作的高度敏感性，这恰好是Dravet综合征的一个标志性特征（如图3所示）。基于此，我们将Scn1a+/−大鼠命名为DS大鼠。

（在热诱导过程中，DS大鼠出现严重的高温诱发癫痫发作）

      脑电记录（EEG）与行为学分析的结果表明，当体温升高时，杂合突变Scn1a+/−大鼠会展现出剧烈的癫痫样行为，诸如抽搐、肌肉强直和身体僵硬等，这些症状与Dravet综合征患者在发热后所经历的惊厥发作相吻合。此外，在初次热惊厥发作之后，Scn1a+/−杂合突变大鼠频繁地自发出现癫痫发作，其脑电特征与患者的脑电活动高度一致。

（DS大鼠在高温诱发癫痫发作及随后自发性癫痫发作时的癫痫样脑电图（EEG）活动）

二、总结

CRISPR-Cas9技术结合输卵管电转染（i-GONAD）显著简化了转基因动物生产。本研究中，利用i-GONAD技术成功敲除Scn1a基因，效率达75%，与先前研究相符。所得Scn1a+/−大鼠在基因和表型上与Dravet综合征患者高度一致，为DS基因治疗研究奠定基础。最佳电转条件为NEPA 21施加350 mA电流。i-GONAD技术无需预测脱靶效应，节省时间且高效。

参考文献

• 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.nbd.2023.106193
  
• Li M, Yang L, Qian W, Ray S, Lu Z, Liu T, Zou YY, Naumann RK, Wang H. A novel rat model of Dravet syndrome recapitulates clinical hallmarks. Neurobiol Dis. 2023 Jun 8;184:106193.  Epub ahead of print. PMID: 37295561.
  
• Bender, A.C., Morse, R.P., Scott, R.C., Holmes, G.L., Lenck-Santini, P.P., 2012. SCN1A mutations in Dravet syndrome: impact of interneuron dysfunction on neural networks and cognitive outcome. Epilepsy Behav. 23, 177–186. 
  
• Born, H.A., Martinez, L.A., Levine, A.T., Harris, S.E., Mehra, S., Lee, W.L., Dindot, S.V.,Nash, K.R., Silverman, J.L., Segal, D.J., et al., 2021. Early developmental EEG and seizure phenotypes in a full gene deletion of ubiquitin protein ligase E3A rat model of angelman syndrome. eNeuro 8. 
  

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