小鼠全脑脊髓投射神经元的转录组分类学

一、背景

我们分析了65,002个脊髓投射神经元（SPN），鉴定出76种区域特异性类型，并映射至小鼠全脑图谱。这些SPN分为三类：（1）皮层、红核、小脑中的兴奋性SPN，适合点对点通信；（2）网状结构中的异质SPN，适合广泛传递脊髓活动相关命令；（3）下丘脑、中脑及网状结构中的调节神经元，用于调整脑脊髓信号。

二、研究路线

研究采用15只P56成年小鼠（8雌7雄用于10X v3.1，6雌9雄用于SMART-Seq v4）的全脑组织。在P42时，向小鼠脊髓颈部注射GFP病毒，腰部注射mScarlet病毒。P56时，通过STPT和切片成像评估SPN分布。随后，显微解剖标记小鼠的主要ROI，每个ROI作为独立样本（雌雄均衡），经FANS后进行10X v3.1或SMART-Seq v4单核RNA测序。

通过荧光强度筛选，去除次生标记细胞核后，获得65002个高质量SPN snRNA图谱（10x: 61484，SSv4: 3518）。经多层级聚类，SPN分为三大类：皮层、中脑、小脑谷氨酸能神经元（34565，53.18%），中脑、后脑谷氨酸能或抑制性神经元（23174，35.65%），皮层下调节神经元（7263，11.17%）。进一步细分为13个子类及76个类型，并通过数据整合验证了分类的一致性。

三、研究结果

1、SPN 转录组图谱的生成

研究者团队开发了一种管道，用于标记、成像和分析成年小鼠全脑中的SPN核。通过注射重组逆行腺相关病毒，逆行标记SPN，并在P56时通过STPT评估其解剖分布。SPN广泛分布于小鼠大脑，主要集中在CTX、HY、MB、CB、PONS和MED。随后，采用FANS和snRNA-seq进行转录组分析，通过多级迭代聚类将SPN分为三大类（谷氨酸能神经元、谷氨酸能和GABA/甘氨酸能神经元、皮质下调节神经元），并进一步细分为13个亚类和76个类型。UMAP空间中的无监督聚类和可视化揭示了细胞核的分离和重叠类型，反映了大脑区域的解剖连续性和转录组相似性。该方法成功地将SPN类型分配到传统定义的脊髓投射群体中。

全脑脊髓投射神经元的解剖学转录组图谱

2、SPN 的转录组景观

转录组和空间注释将SPN分为三个主要部分，代表脊柱投射通路的三个关键组件。第一部分（第1区）包括CTX、MB和CB中的谷氨酸能神经元，分为三个子类（CTX glut、MB glut、CB glut）和七个类型。CTX glut子类对应CSN，表达Vglut1和第五层标记；MB glut子类包括三种RuSN类型，表达Vglut2和特定标记物；CB glut子类对应CbSN，也表达Vglut2和Rreb1。这些神经元的共同特征是特定的体位位置和脊髓投射，且在第1区中，GFP和mScarlet标记的细胞明显分离。

来自皮质第 5 层、红核和小脑的 SPN 在转录和解剖学上都是离散的

皮质下调节神经元分为5亚类20类型，分布于HY、MB和HB，与神经肽和/或慢速神经递质相关，放大/延长快速命令，形成“情绪运动路径”。下丘脑脊髓神经元主要起源于室旁HY和外侧区，表达Slc17a6和多种神经肽。MB类型包括“MB Mod”亚类，其中“MB-EW-Cck-Ucn”型富含神经肽基因，缺乏速效神经递质标记。PONS和MED的调节性SPN分别对应蓝斑和中缝核。部分神经元表达双重或部分神经递质类型机制，如GABA/Glyc群体和MED-Lhx1/5-NTS型神经元。

SPN 的不同神经递质特性

3、成年ReSN的LIM转录因子代码

ReSN是解剖和转录结构最复杂的SPN类型，源于桥脑延髓网状结构，调节多种功能。研究者根据LIM同源盒基因表达模式，将ReSN分为五个“LIM组”，并进一步细分为亚类和类型。Lmx1b组根据神经递质分为三个亚类。Chx10是ReSN的常用标记物，与Lhx3/4组表达一致。存在一个“LIM代码”用于分类成年ReSN，反映了LIM基因在神经元特性中的作用。通过单细胞调控网络分析和与MERFISH数据集结合，确定了LIM定义类型的解剖分布。研究结果全面定义了ReSN的细胞组成，揭示了其异质性和解剖起源的转录过程。

LIM 同源框基因将网状脊髓神经元分割成空间和转录上不同的子集

4、脊髓靶点的分子特征

为了了解SPN的脊髓投射特性，研究者分析了76种转录定义的SPN类型的投射模式，发现大多数类型包含混合投射靶点的SPN，而少数类型仅投射到特定脊髓区域。桥髓网状结构的类型富含双和/或腰椎投射的SPN。差异表达分析揭示了不同脊髓靶点SPN的转录特征，包括Epha4、Epha6、Epha7和Efna5等差异表达基因。进一步分析确定了CSN和RuSN中颈椎和腰椎/双突出神经元间的差异表达基因，相关通路涉及轴突引导、长度和神经传递，可能与功能调节和结构维持有关。

终止于不同脊柱靶点的 SPN 之间的转录组差异

5、快速发射 SPN 的独特特性

研究者分析了SPN类型中标记基因的表达，发现Pvalb、Kcng4和Spp1在多种SPN中共表达，且在不同类型的RuSN中表达有差异。Spp1阳性和阴性RuSN在电生理和细胞大小相关基因上存在差异表达。免疫组化显示SPP1+和SPP1-RuSN在红核的不同区域分布。电生理记录显示SPP1+RuSN具有更大的体细胞、更快的动作电位和更高的自发放电率，以及更小的输入电阻和更差的可激性。

红核脊髓类型的解剖学、形态学和电生理学

四、结论

本研究对65002个SPN进行了转录分析，鉴定了76种区域特异性SPN类型，并将其映射到小鼠大脑图谱中。研究揭示了SPN的三部分组织特征：同质兴奋性SPN、异质网状结构SPN和调节神经元。同时，发现了LIM同源框转录因子代码，将网状脊髓神经元分为五个不同的群体。此外，研究还确定了具有大胞体尺寸的SPN子集的转录特征，并将其与快速放电的电生理特性联系起来。总之，该研究建立了全脑SPN的综合分类法，并深入探讨了SPN在大脑对身体功能控制中的功能组织。

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