反应体系：使用SYBRGreen染料法，反应体系12.5 μL。

循环参数：包括95℃变性30s（1个循环），95℃变性5s，60℃退火30s（扩增40个循环）。

数据分析：以β-actin为内参基因，使用2^-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平。引物序列见表2。

慢性束缚肠道应激损伤小鼠模型的构建与评价

目的：结合社会心理应激导致炎症性肠病、肠易激综合征等一系列疾病的特点,建立实验性慢性束 缚小鼠肠道应激损伤模型,为探讨慢性束缚应激诱导胃肠病的致病机制以及防治措施奠定基础。

1. 材料

1.1 实验动物

种类与数量：18只雄性7周龄SPF级BALB/c小鼠

体重：21 ~ 23 g

饲养环境：SPF级屏障环境，恒温23 ± 2 ℃，相对湿度40% ~ 60%，明暗交替12 h/12 h，自由采食和饮水

1.2主要试剂

RNA提取与PCR：TRIgent试剂盒、qRT-PCR Mix、逆转录试剂盒

基因引物：生工生物工程(上海)股份有限公司合成

免疫组化相关：HE染液套装、抗原修复液、抗荧光淬灭封片剂、DAPI染色试剂、BSA、CY3标记山羊抗兔IgG

抗体：Occludin、Cleaved Caspase-3、Claudin-1、ZO-1、β-actin

发光与定量：ECL超敏发光液、BCA蛋白定量试剂盒

显色与标记：DAB显色试剂盒、酶标山羊抗兔IgG聚合物

1.3主要仪器

PCR仪：Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System

组织处理：组织匀浆机、病理石蜡切片机、组织包埋机

定量与分析：核酸蛋白定量仪、标准规格酶标仪、全波长酶标仪

成像系统：ChemiDoc成像系统、显微镜及成像系统、明场及荧光FISH数字病理扫描仪、正置光学显微镜

2. 方法

2.1 分组

分组：将小鼠随机分为对照组（Ctrl group）和慢性束缚应激组（CRS group），每组9只。

应激处理：CRS组小鼠每天9:00~12:00被置于自制行为限制装置中束缚3小时，持续14天。

2.2 组织样本采集

时间：实验结束后，小鼠禁食6小时后进行。

麻醉与处死：使用1%戊巴比妥钠按5 μL/g体重腹腔注射麻醉，断颈处死。

样本处理：采集十二指肠和结肠组织，一部分用于分子指标检测（液氮冷冻，-80℃保存），另一部分用于组织切片制作（4%多聚甲醛固定）。

 2.3组织切片及HE染色

步骤：组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（5 μm）、粘片、烘片、HE染色。

观察与测量：镜下观察拍照，使用Image J软件测量十二指肠绒毛长度和隐窝深度。

评分：根据病理组织学评分表（表1）对结肠病理切片进行评分。

 2.4 RNA提取及反转录

样本处理：约50 mg组织加入TRIpure后低温匀浆裂解。

RNA提取：通过氯仿、异丙醇等步骤提取RNA，并用DEPC水溶解。

质量测定：使用NanoPhotometer-N50-Touch分光光度计测定RNA浓度和质量。

反转录：根据反转录试剂盒说明书，取2 μg总RNA进行逆转录反应得到cDNA。

  2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应分析

反应体系：使用SYBRGreen染料法，反应体系12.5 μL。

循环参数：包括95℃变性30s（1个循环），95℃变性5s，60℃退火30s（扩增40个循环）。

数据分析：以β-actin为内参基因，使用2^-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平。引物序列见表2。

2.6 蛋白免疫印迹分析

关键步骤：

蛋白质提取：使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA buffer从小鼠十二指肠、结肠中提取总蛋白。

蛋白定量：通过BCA蛋白定量试剂盒确定蛋白浓度，确保每个样本上样量一致（如30 μg）。

电泳分离：在SDS-PAGE凝胶上，通过电泳按分子量大小分离蛋白质。

转膜：将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，以便后续抗体检测。

抗体孵育与检测：使用特异性抗体（一抗和二抗）识别并标记目标蛋白，最后通过ECL超敏发光液显影曝光拍照。

 2.7 免疫荧光染色

目的：在细胞或组织切片上定位特定蛋白质，并观察其分布。

关键步骤：

抗原修复：使用EDTA抗原修复液处理石蜡切片，暴露抗原表位。

封闭：使用3% BSA封闭非特异性结合位点。

抗体孵育：一抗4℃过夜孵育，特异性结合目标蛋白；随后二抗室温孵育，与一抗结合并带有荧光标记。

细胞核染色：DAPI染色标记细胞核，便于观察细胞形态。

图像采集：使用荧光显微镜观察并采集图像，根据荧光标记的颜色和亮度判断目标蛋白的表达和分布。

3、统计学分析

 数值用平均值  ±  标准误差(???? x  ±  s???? x)表示,统计 分析用SPSS 26.0软件进行,组间的比较分析用配 对t检验进行检验,P  <  0.05为差异具有显著性。 使用GraphPad Prism 9.0绘图

4.结果

4.1 慢性束缚应激对小鼠体重及肠道组织结构的深刻影响

4.1.1体重骤减现象：

实验结果显示，与对照组小鼠相比，经历慢性束缚应激的小鼠体重发生了显著的下降（P < 0.0001）（见图1），这一发现与过往的研究结果相吻合。

4.1.2十二指肠绒毛形态学的显著变化：

采用苏木素-伊红（HE）染色技术观察，我们发现慢性束缚应激组小鼠的十二指肠绒毛形态发生了明显变化，具体表现为绒毛的缩短和脱落（图2A）。进一步量化分析揭示，这些小鼠的绒毛高度显著降低，且绒毛高度与隐窝深度的比值也呈现出显著的下降趋势（P < 0.0001）（图2B ~ 2D）。

4.1.3结肠组织的病理损伤：

在结肠方面，慢性束缚应激同样展现出了其不良影响。与对照组相比，应激组小鼠的结肠黏膜出现了明显的炎性细胞浸润，且隐窝结构呈现出异常状态。病理组织学评分的显著升高（P < 0.05）进一步证实了结肠组织受到了一定程度的病理损伤（图3）。

4.2 慢性束缚应激对肠道紧密连接蛋白表达的关键影响

4.2.1十二指肠紧密连接蛋白表达下调：

为了深入探究慢性束缚应激对肠道屏障功能的潜在影响，我们检测了肠道组织中代表性紧密连接蛋白的表达情况。结果显示，与对照组相比，慢性束缚应激显著降低了小鼠十二指肠紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达水平（P < 0.01），如图4所示。

4.2.2Occludin原位表达减少的直观证据：

为了更直观地展示这一变化，我们进一步进行了免疫荧光分析。结果显示，慢性束缚应激确实能够降低十二指肠组织中紧密连接蛋白Occludin的原位表达（图5）。

4.2.3结肠紧密连接蛋白Occludin表达的下调：

类似地，在结肠组织中，我们也观察到了紧密连接蛋白Occludin表达的下调（P < 0.05），如图6所示。这表明慢性束缚应激对肠道屏障功能的影响不仅局限于十二指肠，还扩展到了结肠等远端肠道部位，进一步强调了应激对肠道整体健康的不良影响。

4.3 慢性束缚应激对肠道组织炎性细胞因子表达的关键提升

4.3.1十二指肠炎性细胞因子与趋化因子的显著上调：

为了评估慢性束缚应激对肠道炎症反应的具体影响，我们检测了多种代表性炎性细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比，慢性束缚应激显著提高了小鼠十二指肠中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1以及抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达（P < 0.05），如图7A所示。

4.3.2结肠炎性细胞因子与趋化因子的强烈反应：

在结肠组织中，慢性束缚应激同样引起了强烈的炎性细胞因子和趋化因子反应。具体来说，IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达水平在应激组小鼠中显著升高（P < 0.001），如图7B所示。

4.4 慢性束缚应激诱导的肠上皮细胞凋亡重点发现

4.4.1十二指肠上皮细胞凋亡显著增加：

通过免疫组化技术，我们直接观察到了慢性束缚应激对小鼠十二指肠上皮细胞凋亡的显著影响。结果显示，与对照组相比，应激组小鼠的十二指肠上皮细胞凋亡明显增加（图8A）。进一步分析凋亡标志物Cleaved Caspase-3的免疫组化表达，我们发现其表达水平在应激组小鼠中显著上升（P < 0.05）（图8B），这为十二指肠上皮细胞凋亡的增加提供了直接证据。

4.4.2结肠上皮细胞凋亡趋势的增强：

类似地，在结肠组织中，我们也观察到了慢性束缚应激对上皮细胞凋亡的影响。尽管具体统计显著性可能因实验条件而有所差异，但免疫组化结果显示，结肠凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表达在应激组小鼠中呈现出增强的趋势（图8C, 8D）。 

5. 讨论

 本研究通过模拟社会心理应激环境，建立了CRS小鼠肠道应激损伤模型，观察到模型小鼠出现肠组织病理损伤和屏障功能障碍，伴随炎性细胞因子表达升高和肠上皮细胞凋亡增加。CRS与IBD、IBS等胃肠道疾病密切相关，能模拟这些疾病的病理状态，如腹泻、内脏超敏和免疫调节障碍。本研究结果表明，CRS可能通过增加肠道炎症反应、破坏紧密连接蛋白和诱导细胞凋亡等途径，导致肠道屏障功能受损。这为揭示CRS及其相关胃肠道疾病的发病机制提供了新视角，并为进一步的药物干预和治疗研究奠定了基础。然而，CRS的具体致病机制仍需进一步深入研究。

参考文献：郑建华,陈菁青,董巧燕,等. 慢性束缚肠道应激损伤小鼠模型的构建与评价 [J]. 中国实验动物学报, 2024, 32(2): 190-201.

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