脾脏在慢性应激促肝癌进展中的作用

       随着医学模式转向生物-心理-社会综合模式，研究发现慢性应激与肿瘤关系密切。心理治疗、社会支持和抗应激药物能改善肿瘤患者预后。慢性应激通过应激激素促进肿瘤，其中免疫因素尤其是高CCR2单核细胞转化的TAM起关键作用。脾脏既影响单核巨噬细胞生成，也参与肿瘤免疫耐受。虽然脾脏对肿瘤发展有复杂影响，但其在慢性应激促进肝癌中的作用尚不明确。本研究将探究脾脏在此过程中的具体作用。

1. 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄雄性C57BL/6小鼠28只，体重(20±2)g，为SPF级。

1.2 细胞株及细胞培养

H22细胞株。

H22细胞在含有10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的1640完全培养基环境中，置于设定条件为5%CO2浓度、37摄氏度温度及饱和湿度的细胞培养箱内培养24小时。随后，使用15毫升的离心管收集这些细胞，进行常温下的1000转/分钟离心处理，持续5分钟。离心后，丢弃上层液体，以生理盐水重新悬浮细胞，以备后续使用。

1.3 主要抗体

大鼠抗小鼠PE/Cyanine7-labeled CCR2、大鼠抗小鼠PE-labeled Ly6C、大鼠抗小鼠CD16/32、大鼠抗小鼠APC-labeled CD11b、大鼠抗小鼠Brilliant Violet 421TM-labeled CD45抗体。

1.4  慢性束缚应激荷瘤小鼠模型的建立

小鼠适应环境2周后，每天束缚应激2小时，持续5天。随后，将复苏并培养的H22肝癌细胞注入小鼠腹腔，待其形成腹腔积液后，收集并处理这些积液以获取H22细胞，再将其稀释并注射到小鼠皮下建立肝癌模型。接种后继续应激21天。

1.5 脾切除及假手术

为排除手术干扰，小鼠在应激前2周接受脾切除或假手术。麻醉后，消毒腹部并开腹，脾切除组结扎并剪断脾脏血管后摘除，确认无出血后缝合；假手术组仅开腹后缝合。术后消毒并保温复苏小鼠。

1.6 外周血及肿瘤单细胞悬液制备

小鼠接种肿瘤3周后，眼球取血并加抗凝剂处理，同时摘取肿瘤称重。血液样本经红细胞裂解、PBS洗涤后，获得细胞悬液并调整浓度备用。肿瘤组织则经剪碎、酶解、过滤及PBS洗涤后，同样得到单细胞悬液并调整浓度，两者均置于冰上以备后续分析。此过程确保了血液与肿瘤样本中细胞的有效提取及适宜浓度的制备。

1.7 流式细胞术检测肿瘤和外周血

CD11b+Ly6C+CCR2+单核细胞的比例 吸取100 μL上述制备的细胞悬液加入流式管中，用抗大鼠抗小鼠CD16/32抗体4 ℃孵育15 min，按说明书加入适量的CCR2、Ly6C、CD11b、CD45抗体，4 ℃避光孵育30 min，后加入含1%胎牛血清的PBS 2 mL，4 ℃下350 g离心5 min，弃去上清液；重复1次，最后加入0.5 mL PBS重悬，用FACS Canto Ⅱ flow cytometer检测结果。

1.8 统计学方法

 应用SPSS 13.0统计学软件分析数据。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 慢性应激对肝癌进展的影响

研究发现，通过连续5天预束缚应激，随后接种肿瘤并继续21天束缚应激的慢性应激模型，显著影响了肝癌的进展（见图1）。具体表现为：应激组小鼠的肿瘤重量（0.283±0.047 g）显著高于未受应激的对照组（0.109±0.040 g），且这一差异具有统计学显著性（t=2.810，P=0.023），表明慢性应激加速了肝癌的发展。

2.2 慢性应激CD11b+Ly6C+CCR2+单核细胞的影响

流式细胞术分析显示，慢性应激显著提升了荷瘤小鼠外周血中CD11b+Ly6C+CCR2+单核细胞的比例（P

2.3 脾脏在慢性应激促肝癌进展中的作用

用脾切除的手段探讨脾脏在慢性应激促肝癌进展中的作用。结果显示，假手术应激组肿瘤重量明显高于假手术组和脾切除应激组，差异有统计学意义(P

2.4 脾切除对慢性应激荷瘤小鼠CD11b+Ly6C+CCR2+单核细胞的影响

研究发现，脾切除不影响慢性应激荷瘤小鼠外周血或肿瘤组织中CD11b+Ly6C+CCR2+单核细胞的比例变化。尽管假手术应激组外周血这些细胞比例较高，但与脾切除应激组无显著差异。肿瘤组织内这些细胞比例在各组之间也未见显著差异。见表3。

3. 讨论

研究表明，慢性应激通过增加CD11b+Ly6C+CCR2+单核细胞促进肝癌进展，这些细胞是肿瘤免疫微环境的关键部分。脾脏作为免疫器官和单核巨噬细胞来源，在慢性应激促肿瘤中起促进作用。切脾能减缓肿瘤生长并减少此类单核细胞在外周血的比例，表明慢性应激下这些细胞可能源自脾脏。具体机制需进一步研究。

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