不同方法建立小鼠肝癌原位移植瘤模型差异性的探讨

      原发性肝癌（PLC）为我国常见恶性肿瘤，肝细胞癌（HCC）占主导。现有两种肝癌动物模型：皮下移植模型简便但模拟不全，原位移植模型则更贴近自然病程。本研究建立了三种小鼠原位肝癌模型，包括注射H22细胞悬液、腹水细胞及移植组织块，并评估了术后状态、肿瘤生长、转移、B超、血清生化及病理变化，旨在比较不同建模方法的优劣，为肝癌研究提供精准动物模型。

1. 材料与方法

1.1.1 实验动物

实验动物：

• SPF级雄性KM小鼠80只
  
• 4周龄
  
• 体重18-22g
  

实验与饲养条件：

• 严格按照SPF级实验动物规范要求执行。
  
• 小鼠自由饮水、摄食。
  
• 室温维持在22-25℃
  
• 相对湿度50%-70%。
  
• 光照与黑暗交替周期为12小时。
  
  1.1.2 细胞
  小鼠肝癌H22细胞株、腹水型肝癌H22细胞株.
  
  

1.2 方法

1.2.1 小鼠原位肝癌模型的建立

（1） 注射肝癌H22细胞悬液法：A组：取20只小鼠，制备1x10^7/mL的H22细胞悬液。麻醉小鼠，脱毛消毒后开腹，外翻肝脏，注射100μL H22细胞悬液至肝左叶，驻针5秒，止血缝合。恢复后移入鼠笼。

（2）注射腹水型肝癌H22细胞法：B组：另取20只小鼠，使用调整至1x10⁷/mL的腹水型肝癌H22细胞，按A组相同步骤接种至肝左叶，待小鼠恢复后移入鼠笼。

（3）小鼠肝癌组织块移植法：取20只小鼠，皮下接种1x10^6/mL的腹水型肝癌H22细胞200μL。7天后取皮下瘤块(1mm³)，经无菌处理备用。小鼠麻醉开腹后，于肝内植入此瘤块，缝合恢复后移入鼠笼。

（4）假手术组：该组定义为D组,随机取 20 只小鼠,采用与注射肝癌 H22 细胞悬液法同样方法进行手术操作,但不进行注射细胞,仅注射生理盐水100 μL。

1.2.2 小鼠原位肝癌模型的筛选

• 术后观察：建模后，每2天监测小鼠饮水、进食、精神状态及体重。
  

• 成瘤评估：术后第25天，每组随机选取10只小鼠处死，评估成瘤率。
  

• 生存期监测：剩余小鼠继续观察，使用GraphPad Prism 8.0绘制生存曲线。
  

• 腹腔粘连分级：改进分级法评估肝肿瘤与周围组织的粘连程度。
  

• 肿瘤转移检测：检查腹水及腹腔、脏器（脾、肾、胃、肠、肺）的肿瘤转移情况。
  

• 超声检查：术后第25天，使用Vetus7型超声仪对各组小鼠进行超声成像。
  

• 血清标志物检测：术后第25天，酶联免疫法测定AFP、DCP水平。
  

• 病理形态学分析：切除肝肿瘤，固定、包埋、切片、染色后，光镜下观察肝组织病理变化。
  

1.2.3 统计学分析

整理数据,使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析,计算结果用平均值 ± 标准差(???? x ± s)表示。 P  <  0.05表示差异具有显著性。

2. 结果

2.1 肝癌原位移植模型建立

       在对比A、B、C三组肝癌原位移植模型的制备方法时，A组和B组手术时间（2-3分钟）显著短于C组（5-6分钟），主要是因为A、B组通过肝部注射细胞，减少了出血，简化了操作。相比之下，C组需肝部切开，易引发大量出血，操作复杂且耗时更长，还导致1只小鼠死亡和肿瘤易脱落问题。统计显示，A、B组手术时间分别为(3.36±0.44)min和(3.30±0.41)min，显著低于C组的(5.68±0.65)min，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2 小鼠体重变化

       术中C组1小鼠因失血过多死亡，但术后A、B、C、D组其余小鼠均存活且健康，伤口愈合良好无感染。体重监测显示：A组小鼠前13天体重稳定，后体重激增，第25天达峰值（31.8±1.6）g，可能受腹水影响；B组第17天体重达峰（26.9±0.6）g后下降，C组20天内体重增长缓慢后下降，均可能与健康状况恶化相关；D组体重平稳增长。第25天，A、C组与D组小鼠体重差异显著（P

2.3 小鼠活动状态

建模后小鼠总体状况良好，但A组第20天出现毛发无光、精神萎靡、腹大及活动减少；B组自第12天腹大，18天后进食减少，活动迟缓，生命状态恶化；C组则相对活跃，毛发有光泽，无腹肿；D组最为活跃，进食饮水均正常。

2.4 小鼠生存时间

D组小鼠一直存活;A 组小鼠最长活到 37 d,平均生存时间(32.47+3.79)d;B 组小鼠最长活到 30d,平均生存时间(27.40±1.89)d;C 组小鼠最长活到38d,平均生存时间(35.20±2.73)d。但A组、B组、C组3组间无显著性差异(P>0.05)

2.5 小鼠腹腔脏器粘连程度

A组、B组、C组小鼠腹腔轻度粘连率分别为60.0%、40.0%、100.0%:腹腔重度粘连率分别为40.0%、60.0%、0.0%。D组未出现轻、重度腹腔粘连。

2.6 小鼠肝样本肉眼观察及肝部肿瘤成瘤情况

接种25天后，各组小鼠成瘤率均为100%。A、B、C组肝部瘤体形态各异，D组则未见瘤块。A、B、C组肝重显著高于D组，且瘤重差异显著。B、C组肝指数远高于D组。A、B组小鼠出现腹水与腹壁瘤，C组无。A、B组或存细胞溢漏，使用电烙铁止血。A、B组肝内多结节，B组还现腹水瘤细胞肝外转移至胃肠，疑为脉管系统介导的肝转移。

2.7 小鼠肝B超成像

D组小鼠肝部B超显示正常，而A、B、C组小鼠肝部B超异常，均见低回声包块。解剖确认A、B、C组小鼠肝部有肿瘤结节，证明三种造模方式均成功实现肝癌移植。

2.8 小鼠血清AFP、DCP浓度的比较

肝癌模型小鼠（A、B、C组）血清中AFP和DCP水平显著高于正常小鼠（D组），分别高出13-19倍和5-8倍。B组小鼠这两项指标均显著高于A、C组，而A、C组间无显著差异。

2.9 小鼠肝组织病理形态

D组小鼠肝组织正常，无病变。A、B、C组小鼠肝组织分界模糊，肿瘤细胞形态多样且排列紊乱，部分区域坏死。病理切片与解剖、B超结果一致，表明三种造模方式均成功构建肝癌模型。

3. 讨论

肝癌模型是研究肝癌的基石，本文探讨了注射肝癌H22细胞悬液、注射腹水型肝癌H22细胞及移植肝癌组织块三种建模法。结果显示，三者均能有效构建肝癌原位模型。细胞注射法简便且易成瘤，但腹腔粘连重；组织块移植法则对腹腔影响小。这些模型为肝癌研究提供了可靠动物模型，对肝癌的预防、诊断和治疗研究具有重要参考价值。

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