PCR检测实验室的污染及对策

       近年来，集约化养殖加剧了动物疾病传播，促使科学家发明了PCR技术以科学检测疫病。PCR（聚合酶链式反应）

能高效扩增特定DNA片段，简化操作，提升灵敏度，为动物疫病检测提供可靠依据。然而，其强扩增性也易导致污染，

引发假阳性。作为体外DNA复制的利器，PCR在动物疫病防控中成效显著，未来实验室条件优化将进一步提升其应用效果。

一、引起PCR污染的原因

 PCR试剂的污染：PCR试剂污染主要源于配制过程中加样器具、容器及溶剂等被核酸模板污染，因此，妥善保护试剂与器材是减少污染接触的关键。

样本间的交叉污染：PCR样本交叉污染主要因样本储存密封不严或容器污染，以及实验操作不当（如移液枪污染）导致。避免时需注重细节，确保密封良好，器材清洁，操作规范。

PCR扩增产物污染：PCR扩增产物的高拷贝量易成为主要污染源，因其远超检测极限，微量污染即可致假阳性，对实验室环境构成严重威胁。

 操作者的污染：在实验的过程中，由于操作者过于注重操作的结果和效益，往往在实验的过程中就会因为心急造成误操作，或者自身的头发、皮肤等当中含有的细菌都会带来PCR的污染。这不仅仅是个人的实验室防护措施没有做好，更重要的是实验室的操作安全知识以及细节没有从整体上有清晰的认识，长时间这样开展实验肯定是对实验的不重视，其结果可想而知。

二、防止污染的措施

1.  对PCR实验室合理分区：PCR实验室合理分区是防污关键，分标本处理、PCR扩增、产物分析三区，确保各区域独立运作，使用专用器械，严格隔离操作，避免交叉感染，从根本上控制实验室污染，保障实验准确性与安全。
   
   
   
2. 良好的实验室操作习惯：操作不当常致实验结果偏差与样本交叉污染，此乃实验室科研之大忌，彰显对科学之不敬。故入实验室前，务必全副武装；操作中，须培养良好的习惯，器具定位存放，严禁混用，以维护实验精准与纯净，彰显对科学之严谨态度。
   
   
   
3. 合理的试剂分装与贮存：为防止PCR实验污染，有效策略包括合理分装与贮存试剂。应减少试剂包装量，避免大瓶多次使用致污染。PCR反应液预配后小量分装，存储于-20°C，减少取用频率，从而降低交叉污染风险，保障实验成功率与数据准确性。
   
   
   
4. 实验设计尽量减少PCR循环次数：为减PCR污染，应精简PCR循环次数，确保产物达检测标准即可，避免高浓度产物污染。一旦发现污染，需迅速定位污染源，确保实验顺畅进行。此策略经多次验证，广受实验科学家认可，有效降低了PCR污染风险，提升了实验效率与准确性。
   

三、污染的监测方法

1. 阳性对照：PCR实验室及检验单位应设PCR阳性对照，作为反应成功与产物准确的参照。优选中等扩增、重复性好且鉴定无误的标本。重组质粒对照含量应低（＜100拷贝）。但高浓度对照易污染样本，故在试剂稳定、人员熟悉后，可酌情省略阳性对照，以减少污染风险。
   
2. 阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
   
3. 重复性试验
   
4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增
   

四、污染后的处理方法

1. 环境污染：
   稀酸清洁法：针对疑似污染的器具，采用1mol/L盐酸进行表面擦拭或浸泡处理，该处理能有效促使残留的DNA发生脱嘌呤作用，从而去除潜在的污染源。
   紫外线（UV）消毒法：选用254/300nm波长的紫外线进行照射，持续30分钟。但应用此方法时需谨慎评估PCR产物的特性，因其对长度超过500bp的长片段效果较佳，而对短片段则影响有限。UV照射机制在于诱导嘧啶碱基间形成二聚体，阻碍DNA链的进一步延伸。然而，并非所有嘧啶均能形成二聚体，且已形成的二聚体也可能在UV持续照射下断裂。此外，二聚体的形成效率受UV波长、二聚体类型以及相邻核苷酸序列的复杂影响。
   

        2. 反应液污染：

DNase I处理：向PCR预混液（除模板和Taq酶）加DNase I，室温反应后灭活，再加入模板和酶进行PCR。优势在于无需知污染DNA序列。

内切酶处理：采用识别4碱基的多种内切酶，室温处理并灭活后PCR，以克服单酶特异性限制。

紫外照射法：对不含模板和Taq酶的PCR混合液进行紫外照射，遵循既定UV照射指南。

g射线消毒：g射线通过离子化水产生自由基破坏DNA，1.5-4.0kGy范围内有效去除DNA污染，但高剂量影响PCR效率，引物相对稳定。