裸鼠盲肠黏膜下注射 HCT116 细胞建立结肠癌原位种植及转移模型的研究

       我国结直肠癌发病率攀升至恶性肿瘤第三，复发与转移是治疗难题。为探究其浸润转移机制及抗转移疗法，构建合理动物模型至关重要。我们改进了传统大肠癌模型，通过在裸鼠盲肠黏膜下注射HCT116细胞，建立了结肠癌原位种植及转移模型，以模拟人类结肠癌的临床演变过程。

1.材料

1.1 肿瘤细胞

人结肠癌 HCT116-LUC2 细胞株。

1.2 动物

SPF级 BALB/e 雄性裸鼠 60 只,体重 18g左右,鼠龄4~6周。

1.3 主要仪器与试剂

MSC 12 超净工作台,CO,培养箱,3-30K 型高速离心机,奥林巴斯倒置显微镜,D90 数码相机，GSY2-I恒温水浴锅。

免抗人癌胚抗原(CEA)多克隆抗体;联苯二胺(DAB)显色试剂盒。

2. 方法

2.1细胞培养

HCT116-LUC2人结肠癌细胞在含10%小牛血清及1%双抗的培养基中，于37℃、5%CO2环境下培养。细胞密度达80-90%时，每1-2天传代一次。为接种裸鼠，需培养约24瓶T25至满瓶（每瓶约5x106细胞），收集对数生长期细胞，经胰酶消化、离心及PBS重悬后，调整浓度至4.0x1010/L，以满足每只裸鼠接种2x106细胞的需求，总计需约1.2x108细胞。

2.2 接种

术前30分钟紫外线消毒手术室。无菌操作下，以2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠。左下腹切开，暴露盲肠，用微量注射管倾斜进针盲肠壁，注入50μL含4x10^6 HCT116-LUC2细胞的悬液于黏膜肌层间。停留片刻后快速退针，碘酒消毒腹腔，复位盲肠并缝合腹壁。

2.3 取材及检测

2.3.1 肉眼观察 

2周后裸鼠腹部现肿块，确认接种成功。随后分6批，每2周一次，用戊巴比妥钠麻醉处死裸鼠，进行完整解剖，评估盲肠原位肿瘤、淋巴结及肝肺转移情况。期间每2周测量瘤体尺寸，依据公式计算体积并绘制生长曲线，以监控肿瘤发展情况。此方法旨在全面评估结肠癌模型的生长及转移特性。肿瘤体积计算公式:肿瘤体积(mm')=1/2x长(mm)x宽(mm')。

2.3.2 光镜病理组织学观察 

收集盲肠原位瘤、腹腔淋巴结及肝肺组织，经10%甲醛固定后，进行石蜡包埋并切成3-5微米薄片。这些切片经HE染色处理，随后在200倍光学显微镜下进行详细观察与分析。

2.3.3 免疫组化法

遵循试剂盒指南，采用SABC法检测肝肺肿瘤组织CEA表达。经脱蜡、水化、抗原修复、封闭等步骤，依次加入一抗、二抗并显色，复染后封片。同时，设立PBS替代一抗的对照组以确保实验准确性。

2.4 统计方法

采用 SPSS 17.0统计软件进行数据处理,数据用x±s 表示。

3. 结果

3.1 接种后一般情况

裸鼠接种后约20分钟苏醒，活动恢复正常。手术中有2只因麻药或操作问题死亡。术后无并发症，次日排便正常。2周后，成功接种的裸鼠腹部出现硬结肿块，而未成功者腹部柔软。检查发现91%的裸鼠形成瘤结节，病理切片确认为大肠癌，验证了模型构建的成功（图1-A,B为成功与未成功对比，C为瘤结节，D为病理证实）。

3.2 原位肿瘤生长情况

接种后定期测量盲肠肿瘤，发现随时间延长肿瘤浸润生长。前4周生长缓慢，8周后突破肠壁伴溃烂，影响排便但无梗阻。10-12周体积显著增大，侵及周围组织，导致裸鼠健康恶化，死亡4只。表1总结了原位瘤体积变化。

3.3 腹腔淋巴结、肝、肺转移情况

接种4周起，裸鼠腹腔区域淋巴结现转移，6周时加剧，8周时淋巴结广泛浸润。至10-12周，淋巴结显著增大，伴肝肺转移结节。12周时，肝、肺转移率分别为60%、39%，淋巴结全转移。肿瘤生长趋势显示，1-4周缓慢，6-12周则呈指数增长，表明晚期侵袭性增强。

3.4 病理组织学观察及免疫组化分析

光镜下，转移癌与结肠种植瘤结构相似，均为低分化腺癌。肿瘤细胞圆形或椭圆，核大深染畸形，分裂活跃，胞浆饱满，排列成索团状，缺乏腺体结构，显示浸润性。肝肺肿瘤表达人CEA蛋白，呈胞浆内棕黄颗粒，证实转移源自盲肠接种的HCT116细胞（图3-A至D），揭示了肿瘤的高度恶性和广泛转移性。

4.讨论

结肠癌复发与转移治疗棘手，腹腔淋巴结、肝、肺为主要转移部位。目前模型多难模拟真实癌变过程。我们创新性地采用HCT116细胞注入裸鼠盲肠黏膜与肌层间，建立原位癌模型。此模型成瘤率高，稳定模拟结肠癌发展，且肝肺转移显著，操作简便，动物死亡率低。关键在于精准注射，避免肠壁破损。此模型为结肠癌转移机制及药物研究提供了理想平台。

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