尼罗红示踪纳米制剂在荷瘤裸鼠体内活体成像的应用

目的：拟将尼罗红包裹入纳米制剂中,利用其荧光特性来考察纳米制剂在荷瘤鼠体内的肿瘤靶向 性与组织分布情况。

1. 材料

1.1实验动物

种类与规格：SPF级雄性BALB/c裸鼠，4周龄，体重约为(14.95 ± 0.64) g。

1.2 药品与试剂

尼罗红及其制剂：

包括尼罗红(NR)、尼罗红混悬液(NRS)和尼罗红油包水纳米乳(NRNE(O))，用于实验中的荧光标记或检测。

细胞培养相关：

胎牛血清(Gibco)用于提供细胞生长所需的营养；RPMI-1640培养液(HyClone)作为细胞培养基；Cell Counting Kit-8用于细胞增殖检测。

1.3 仪器

电子天平：用于精确称量实验材料。

CO2培养箱：提供细胞生长所需的环境条件（37℃、饱和湿度、5% CO2）。

荧光分光光度计：用于检测荧光标记物的强度，评估尼罗红在细胞或组织中的分布和含量。

活体成像系统：用于在体动物实验中观测荧光标记物的动态变化。

1.4 细胞

细胞株：人小细胞肺癌细胞株NCI-H1688，由陆军军医大学野战外科研究所胸外科提供。

细胞培养：传代：定期进行细胞传代，以保持细胞的活力和数量。传代时应注意无菌操作，避免污染。

筛选与处理：在实验前，可能需要对细胞进行筛选，确保使用的细胞处于良好的生长状态。同时，根据实验需求，可能需要对细胞进行尼罗红或其他试剂的标记或处理。

细胞计数与铺板：在进行实验前，需对细胞进行计数，并根据实验需求将细胞铺板至适当的培养皿或孔板中。

培养基：H1688细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。

培养条件：37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养。

1.5 实验注意事项

无菌操作：在整个实验过程中，必须严格遵守无菌操作规范，防止细胞污染。

细胞状态：密切关注细胞的生长状态，确保使用的细胞处于对数生长期，以提高实验结果的准确性和可靠性。

实验安全：尼罗红等荧光染料可能对人体造成潜在危害，因此在使用时应注意个人防护和实验室安全。

2. 方法

2.1 H1688 肺癌小鼠模型

细胞培养：首先，对人小细胞肺癌NCI-H1688细胞进行常规细胞培养，确保细胞处于健康状态。

细胞准备：选择对数生长期的细胞，因为这些细胞生长迅速，增殖能力强，适合用于建立肿瘤模型。使用培养液调整细胞浓度至5×10^7个/mL。

动物模型建立：在裸鼠（通常为无胸腺小鼠，以排除T细胞介导的免疫反应）右侧腋窝皮下注射0.1 mL的细胞悬液。注射后，细胞将在体内形成肿瘤。

肿瘤监测：每天观察裸鼠的状态，包括活动能力、进食情况、体重变化等。使用游标卡尺定期测量肿瘤的大小（通常测量长度和宽度，并通过公式计算体积），记录数据以评估肿瘤生长情况。

2.2 尼罗红荧光光谱特性

使用荧光分光光度计对尼罗红进行光谱扫描，确定其激发波长和发射波长。尼罗红是一种常用的荧光染料，能够嵌入到脂质滴中并发出荧光，常用于检测细胞内的脂质含量。

2.3 NRNE(O)的细胞毒性试验

通过CCK-8（Cell Counting Kit-8）分析方法来评估NRNE(O)（尼罗红的某种衍生物或改性形式）对NCI-H1688细胞的毒性。CCK-8是一种基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用的细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒。该试剂盒通过检测活细胞中线粒体脱氢酶将WST-8还原为甲臢产物的量来评估细胞活力。

2.4 活体成像实验

分组与给药：选取皮下接种H1688细胞后肿瘤体积约为150 mm³的裸鼠6只，随机分为两组：NRS组（可能代表尼罗红标准品组）和NRNE(O)组，每组3只。按每只裸鼠0.5 mol的剂量分别灌胃给予NRS和NRNE(O)。注意这里的剂量单位（mol）可能需要根据实际物质的摩尔质量和实验设计进行调整，通常更常见的是使用mg/kg作为给药剂量单位。

成像与数据分析：在给药前、给药后1、3、5、12、24小时，将裸鼠置于活体成像仪中进行拍摄。拍摄模式设置为荧光模式，使用尼罗红的激发波长（通常为550 nm）和发射波长（通常为620 nm），曝光时间设为0.1秒。记录并分析不同时间点的荧光强度（CPS），以评估NRS和NRNE(O)在体内的分布和代谢情况。

3. 统计学方法

应用Indigo 2. 0 软件对荧光值进行分析,利用 SPSS 19. 0 软件对裸鼠体重、肿瘤体积及荧光值进 行统计学分析

4. 结果

4. 1　尼罗红的荧光光谱

如图1所示,尼罗红具有良好的荧光光学特性, 550 nm 为最大激发波长,620 nm为最大发射波长。

4. 2　H1688 肺癌小鼠模型的建立

 裸鼠体重及肿瘤体积变化趋势见图2。 接种 H1688 细胞后,裸鼠体重较稳定表明裸鼠状态较好, 其肿瘤生长速度由快到慢。

4. 3　NRNE(O)的细胞毒性

 采用CCK-8法,考察了NRNE(O)对 H1688 细 胞的毒性。 由图3可以看出,当NRNE(O)浓度约 为500 μmol/L 时, 细胞的24 h存活率均高于85%。 这说明NRNE(O)具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。

4. 4　荷瘤裸鼠活体成像

 各实验组不同时间点的成像结果如图4所示, NRNE(O) 组肿瘤部位的荧光强度在5个时间点均 明显强于NRS 组(图 4 红色标记部分为肿瘤), NRNE(O) 组小鼠在给药后3 h和5 h的荧光值均 显著高于NRS组(P< 0.01)。 NRNE(O) 组于3 h 在肿瘤部位的蓄积量最大,5 h 后逐渐减少。 而 NRS 组在肿瘤部位的几乎无蓄积。 随着肿瘤体积 的增加,其荧光强度也逐渐增强,表明尼罗红可作 为纳米乳的示踪剂(如图4D所示)。

5. 讨论

小动物活体成像利用生物发光与荧光技术，对疾病模型检测灵敏度高，具备无创、实时、动态观察优势，减少实验动物用量，符合“3R”原则。本研究采用尼罗红近红外荧光染料，结合纳米乳技术，成功构建了清晰、实时的荧光分布图。前期细胞实验已证实尼罗红可快速进入细胞并作为纳米制剂示踪剂。本研究进一步将尼罗红纳米乳应用于荷瘤鼠体内，通过活体成像技术观察其在肿瘤部位的靶向性和分布。结果显示，经纳米乳包裹的尼罗红显著提高了肿瘤靶向性。此研究不仅拓展了尼罗红的应用领域，还验证了其作为示踪剂与活体成像技术结合的有效性，为纳米制剂在动物体内成像提供了新的研究工具。

文章参考：张凤梅,李可欣,余忠姝,等. 尼罗红示踪纳米制剂在荷瘤裸鼠体内活体成像的应用[J].中国实验动物学报,2019,27(1):91-95.

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