围绝经期综合征肾阴虚证大鼠汗液分泌及其生化指标的变化

       围绝经期综合征常伴盗汗，属血管舒缩症，影响广大女性。西医多依赖激素治疗，但长期使用存健康风险。中医辨证施治有效，却因缺乏针对性实验模型，研究进展受阻。当前，“病证结合”模型融合中西医理念，成为研究热点。本研究拟通过去势大鼠结合L-甲状腺素诱导肾阴虚证模型，探讨其对围绝经期大鼠汗液分泌及相关生化指标的影响，旨在为完善肾阴虚证动物模型观察体系提供实证基础，推动中医理论及中药作用机制的深入研究。

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

• 实验动物：18只SPF级雌性SD大鼠
  
• 年龄：8~10周龄
  
• 体重：200±20g
  
• 环境条件：
  
• 温度：维持在21~25℃
  
• 相对湿度：50±5%
  
• 光照周期：12小时明暗循环
  
• 饲养条件：自由标准饮食饮水
  
• 
  

1.1.2 药物及制备

清骨散(银柴胡 12 g、胡黄连8g、秦艽8g、鳖甲10 g、地骨皮 10 g、青蒿 10 g、知母9%、甘草6g), 采用水煎煮2次,每次 30 min,合并滤液,减压浓缩制成生药量为 7.3 g/kg(临床等效量)的浓缩液。L-甲状腺素，溶解于蒸馏水,超声制成浓度为 92 mg/kg的混悬液。

1.1.3 主要试剂与仪器

• 大鼠环磷酸腺苷(cAMP)ELISA检测试剂盒
  
• 大鼠环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA检测试剂盒
  
• 大鼠雌二醇(E2)ELISA检测试剂盒
  
• 大鼠黄体生成激素(LH)ELISA检测试剂盒
  
• 大鼠促性腺激素释放激素(GnRH)ELISA检测试剂盒
  
• 兔多克隆抗AQP₅
  
• 兔多克隆抗体抗M₃R
  
• 兔单克隆抗β₂AR
  
• 电子天平
  
• 动物体温仪
  
• 酶标仪
  
• 凝胶成像分析仪
  
• 电泳仪
  

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模与给药

本实验涉及18只SD雌性大鼠，随机均分为三组：假手术组、模型组（去卵巢+L-甲状腺素处理）及阳性药组（模型基础上加服清骨散汤剂）。经适应性喂养后，模型与阳性药组大鼠接受去卵巢手术，假手术组仅制造相同伤口。术后各组接受青霉素治疗防感染。通过阴道涂片确认去势模型成功。随后，模型与阳性药组大鼠连续7天上午灌服L-甲状腺素以模拟围绝经期肾阴虚症状。同时，阳性药组下午加用清骨散汤剂，其余组服等量蒸馏水，持续14天。期间监测体温、体重及汗液分泌，最后采血及足跖组织样本以供分析。

1.2.2 鼠温测定

采用热敏电阻式数字温度计贴合大鼠尾部腹面,距离尾根部2cm 左右,并用隔热泡沫隔绝外界温度的干扰,每2d测1次,每只测3次取平均值。

1.2.3 汗斑着色法测定大鼠足跖部汗液分泌

配置和田-高垣试剂A（2g碘溶于100mL无水乙醇）与B（50g可溶性淀粉与100mL蓖麻油混匀）。每次于灌胃清骨散汤剂后30分钟，固定大鼠并擦干足跖部汗液，依次涂抹A液待干后，再涂B液，观察并记录深紫色汗点。重复3次测量，拍照并通过Image Java 8软件计算汗点面积与足跖部面积比。

1.2.4 ELISA法测定血清cAMP、cGMP、E2 、GnRH、 LH水平

腹主动脉取血后静置2~3h,3000 r/min 离心15 min,吸取上层血清,严格按照试剂盒的使用说明检测血清中 cAMP 、cGMP 、E₂、GnRH、LH 水平。

1.2.5 Western Blot测定大鼠足趾组织汗液分泌关 键蛋白表达水平

取100mg足跖组织研磨，加入含PMSF的裂解液提取蛋白，用BCA法定量。蛋白变性后上样SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，封闭后加一抗（AQP₅、β₂AR、M₃R及β-actin）孵育过夜。次日洗涤后加二抗孵育，再洗涤，用ECL显色并分析成像。以β-actin为内参，计算目标蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

所有数据均以均 3次独立实验平均值标准差(x±s)表示,采用 SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析。采用单因素方差分析确定不同组之间的差异显著性,P<0.05 表示具有统计学意义。

2. 结果

2.1 动物一般情况观察

模型组大鼠相较于假手术组，呈现大便干硬、小便黄、饮水增、活动亢奋、易怒等体征，伴随体重下降、毛色差、耳红。阳性药物干预后，上述症状显著缓解。实验终末，模型组体重锐减且体温升高（P<0.01, P<0.001），而阳性药组则有效恢复体重并降低体温（P<0.01, P<0.001），显示治疗效果。

2.2 去势造模后阴道脱落细胞涂片观察结果

大鼠在动情周期的不同阶段，细胞类型各异：前期多为有核细胞，期时则无核角化细胞占主导，后期三者并存（有核上皮细胞、角化细胞、白细胞），而间期则以白细胞为主。假手术组维持了正常的动情周期变化（图3A-3D）。然而，去势术后连续5天的观察表明，大鼠失去了原有的周期规律，持续处于动情间期状态，这标志着去势模型构建成功（图3E-3H）。

2.3 血清cAMP、cGMP、LH、GnRH、E2水平

实验显示，模型组大鼠cAMP水平显著上升，cGMP下降，cAMP/cGMP比值增加，GnRH、LH升高，E₂降低，符合阴虚证特征，表明模型成功。阳性药干预后，cAMP、cAMP/cGMP逆转，GnRH、LH下调，E₂变化不显著（图4）。

2.4 汗液分泌情况

使用和田-高垣试剂测定大鼠足跖出汗，Image Java 8分析显示：去势造模后，模型组汗点数量与假手术组有显著差异（P0.05）。工-甲状腺素造模7天后，模型组汗液显著增多（P<0.001）。未干预模型鼠汗液继续增多，而阳性药干预组汗液显著减少（P<0.001）。

2.5 足趾组织汗液分泌关键蛋白表达水平

模型组足趾肉垫组织的 B,AR、AOP;表达水平显著上调(P<0.05,P<0.01),M,R表达显著下调(P<0.01)。阳性药治疗2周后,大鼠足趾肉垫组织的 B,AR、AQP,表达水平下调(P<0.05,P<0.01),M,R上调(P<0.05)(见图7)

3. 讨论

       本研究通过去卵巢手术结合L-甲状腺素诱导，成功构建了围绝经期综合征肾阴虚证大鼠模型，表现为汗液分泌显著增加、血清cAMP/cGMP比值升高等阴虚症状。采用汗斑着色法量化出汗情况，并结合分子生物学检测，探讨汗液分泌的生物学基础。研究发现，模型大鼠MR受体表达下降，但AQP5和β₂AR表达上调，提示阴虚证出汗与β₂AR激活有关。同时，中药清骨散显著逆转模型大鼠的汗液分泌和血清生化指标，验证了其治疗围绝经期综合征肾阴虚证的有效性。本研究为围绝经期综合征肾阴虚证动物模型的观察及药物疗效评价提供了实验依据。

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