补骨脂素对类风湿性关节炎小鼠模型的免疫调节作用

　目的：探讨补骨脂素对ＩＩ型胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎的作用并初步探讨其作用的分子机制。

1.材料

1.1 实验动物

种类：DBA/1J 小鼠

级别：SPF级

性别：雄性

年龄：6-8周龄

体重：20-22g

数量：35只

饲养环境：温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，自由饮水，每日光照/黑暗各12h

1.2 试剂与仪器

试剂：

牛II型胶原（CII）醋酸溶液、完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）、补骨脂素、注射用甲氨蝶呤、ELISA试剂盒（TNF-α, IL-6, IL-1β）、流式细胞仪抗体（Anti-Mouse CD4, Anti-Mouse IFN-γ, Anti-Mouse IL-4）

仪器：

微孔板分光光度计、流式细胞仪

2. 方法

2.1 小鼠胶原性关节炎（CIA）的诱导

乳化：CII醋酸溶液与CFA等体积混合并充分乳化（冰上操作）

初次免疫：DBA/1J小鼠尾根处后1-2cm处皮下注射100μL CII与CFA混合乳液（含CII 0.1μg）

二次免疫：21天后同样方法注射CII与IFA混合乳液

观察与记录：隔日观察关节症状，记录关节计分

2.2 CIA小鼠关节炎评分标准

评分标准：

0分：无红斑或肿胀

1分：踝关节有轻微红斑或一个趾的肿胀

2分：踝关节出现红斑和超过一个趾的肿胀

3分：红斑和踝部或腕部肿胀

4分：全部红斑及多关节肿胀，踝或腕不能弯曲

总分：每个小鼠四肢评分之和

2.3 分组及给药

分组：

CIA模型组（12只）

甲氨蝶呤阳性对照组（11只）

补骨脂素组（12只）

给药：二免当天开始，连续灌胃给药21天

2.4 炎症因子测定

方法：酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量

步骤：眼眶采血，静置30min，4℃下3000r/min离心10min，取上层血清，按试剂盒说明书操作

2.5 流式分析

步骤：常规提取脾淋巴细胞，计数后按试剂盒说明书进行细胞染色，上机测试

2.6 统计方法

软件：SPSS 13.0

方法：单因素方差分析，实验结果用（x̄±s）表示

3.结果

2.1 关节外观变化及评分

实验观察：

初次免疫后前3周，小鼠未出现关节红肿。二次免疫后，各组小鼠均出现关节炎症状，包括足踝及足趾肿胀、活动受限。（见图一)

组间比较：

在二免后第8天，PSO（补骨脂素）组关节肿胀开始减弱，关节僵直及活动受限程度显著改善，与模型对照组相比差异显著（P<0.01）。

PSO组与MTX（甲氨蝶呤）组相比，关节症状改善程度无显著差异（P>0.05）。(见表一）

评分结果：

给药7天后，PSO组和MTX组的关节计分无显著增加，并呈现略微下降趋势，表明PSO能够减慢关节炎发病进程，缓解症状。（见图二）

2.2 脾及Th1淋巴细胞变化

脾体积与脾指数：

模型对照组小鼠脾体积明显大于PSO组和MTX组。（如图三）

脾指数分析显示，PSO组显著低于模型对照组（P<0.01），与MTX组无显著差异（P>0.05）。（见图四）

Th1淋巴细胞比例：

PSO组CD4+、IFN-γ+标记的Th1细胞占CD4+ T细胞比例显著低于模型对照组（P<0.01），与MTX组无显著差异。

Th2细胞比例在各组间无显著差异。

（见图五）

2.3 炎症因子水平的变化

血清炎症因子检测：

模型对照组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著高于PSO组和MTX组（P<0.01）。（见表二）

4. 讨论

在构建DBA/1J小鼠的CIA模型过程中，我们创新性地采用注射器抽吸法制备乳化液，并通过冰袋冷却减少热量产生，简化操作并降低成本。该模型有效模拟了人类RA的免疫学与病理特征，为研究RA提供了重要平台。

研究发现，补骨脂素能显著降低CIA小鼠的关节病变计分，表明其对关节具有保护作用。机制上，补骨脂素通过调节CD4+T细胞的分化平衡，特别是减少Th1细胞比例，抑制了Th1介导的炎症反应，同时降低了TNF-α、IL-6和IL-1β等关键炎性因子的释放。这一发现揭示了补骨脂素在RA治疗中的潜在抗炎与免疫调节作用，为RA药物研发提供了新的实验依据。然而，补骨脂素的具体分子机制及安全性仍需深入探索。

文章参考：张引红,李美宁,王春芳,郭民,张锐虎,陈朝阳.补骨脂素对类风湿性关节炎小鼠模型的免疫调节作用[J].中国实验动物学报,2017,25(2):207~210.

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