博来霉素诱导大鼠与小鼠肺纤维化模型的评价

目的：采用一次性气管滴注不同剂量博来霉素诱导大、小鼠肺纤维化模型,明确其适宜造模剂量,并比较大、小鼠模型特征。

1.材料

1.1实验动物：

SPF级SD雄性大鼠30只，6-8周龄，体重(200±20)g。

SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，6-8周龄，体重(20±2)g。

1.2饲养环境:

环境严格控制温度(25℃)和湿度(50%)。

1.3药物：

硫酸博来霉素，用于建立肺纤维化模型。

1.4主要试剂与仪器：

HE染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒、羟脯氨酸含量检测试剂盒等。

非束缚小动物肺功能测量仪、光学显微镜及照相系统、低温高速离心机、酶标仪等。

2.方法

2.1分组与模型建立：

将大、小鼠随机分为空白组、博来霉素低剂量组(BLL组)和高剂量组(BLH组)，每组10只。

通过一次性气管内滴注博来霉素建立肺纤维化模型，空白组滴注生理盐水。

2.2体重增长率计算：

监测并记录大鼠和小鼠在造模过程中的体重变化，计算体重增长率。

2.3肺功能检测：

在造模前、第10天和第21天，使用小动物全身体积描记检测系统检测肺功能指标，包括潮气量(TV)、每分钟通气量(MV)和50%潮气量呼气流量(EF50)。

2.4肺组织病理学观察：

取左肺进行固定、包埋、切片和染色（HE和Masson），观察肺组织病理学变化，并进行肺泡炎和纤维化严重程度的评分。(见表1,表2)。

2.5肺组织羟脯氨酸含量测定：

取肺组织样本，通过特定方法提取并测定羟脯氨酸含量，作为评估肺纤维化的生化指标。

2.6统计学分析：

使用SPSS 22.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析比较组间差异，显著性水准设为P<0.05。

3.统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析比较组间差异，显著性水准设为P<0.05。

4.结果

4.1一般情况

 4.1.1C57BL/6J 小鼠

4.1.1.1健康状态变化：

空白组：

作为对照组，小鼠表现出良好的健康状态，包括毛色光亮、精神状态良好、饮食饮水正常、体重稳定增长。尽管在实验中因麻醉操作不当导致初期有两只小鼠死亡，但整体上该组小鼠状态稳定。

BL-L组：

与空白组相比，BL-L组小鼠逐渐出现健康状况下降的迹象。具体表现为毛色逐渐干枯、精神状态倦怠、饮食饮水减少、反应迟钝以及体重显著下降（尤其在实验后期）。此外，该组小鼠的存活率在实验结束时为70%，显示出较高的死亡率。

BL-H组：

作为暴露程度更高的实验组，BL-H组小鼠的健康状况恶化更为明显。它们不仅表现出毛色干枯、精神萎靡、反应不灵敏、不喜饮食和体重显著下降等症状，而且死亡率也更高（最终存活率为50%）。在实验期间，该组小鼠的体重持续下降，且多个时间点上的体重下降均达到统计学显著水平。

4.1.1.2体重变化：

空白组：

体重在实验期间稳定增长，未见明显波动。

BL-L组：

体重在第7天未见明显变化，但随后在第14天和第21天显著降低，表明实验处理对小鼠体重产生了负面影响。

BL-H组：

体重从实验早期开始即显著下降，并在整个实验期间持续降低，显示出更强的负面影响。

4.1.1.3存活率：

空白组：由于实验初期麻醉操作不当导致的死亡外，其余小鼠均存活至实验结束。

BL-L组：在实验期间有多个时间点出现小鼠死亡，最终存活率为70%。

BL-H组：死亡情况更为严重，多个时间点均有小鼠死亡，最终存活率仅为50%。

（见图一）

4.1.2 SD大鼠

4.1.2.1健康状态变化：

空白组SD大鼠在整个实验期间保持了良好的健康状态，包括精神状态良好、毛色光泽、反应灵敏以及正常的饮食饮水行为（尽管由于麻醉操作不当在实验开始时有两只大鼠死亡）。

BL-L组和BL-H组SD大鼠则逐渐表现出健康恶化的迹象。BL-L组大鼠的毛色逐渐干枯，精神变得惓息，反应迟钝，饮食饮水减少，形体消瘦。而BL-H组大鼠的症状更为严重，毛色干枯，精神萎靡，反应不灵敏，几乎不进食，形体极度消瘦。

4.1.2.2存活率：

21天后，BL-L组和BL-H组SD大鼠的存活率分别为70%和50%。这表明实验处理对SD大鼠的存活率产生了显著影响，且随着处理强度的增加（从BL-L组到BL-H组），存活率进一步下降。

4.1.2.3体重变化：

空白组SD大鼠的体重在实验期间保持相对稳定，未见明显变化。

相比之下，BL-L组和BL-H组SD大鼠的体重均显著下降。这种体重降低从实验早期（第7天）即可观察到，并持续至实验结束（第21天）。统计分析显示，这两个处理组在第7、14、21天的体重降低均达到了统计学显著水平（P<0.05, P<0.01）。

（见图二）

4.2肺功能实验

4.2.1C57BL/6J小鼠

4.2.1.1肺功能变化趋势：

空白组：肺功能呈稳定升高趋势。

BL-L组和BL-H组：肺功能虽有升高，但升高速度缓慢。

4.2.1.2关键时间点对比：

第0天：BL-L组和BL-H组与空白组肺功能无显著差异。

第10天：BL-L组和BL-H组肺功能较空白组有所降低，但未达到统计差异水平。

第21天：BL-L组和BL-H组的TV（潮气量）、MV（分钟通气量）、EF50（呼气中期流速）较空白组均显著降低（P<0.05, P<0.01）。

4.1.2.3结论：

实验处理导致C57BL/6J小鼠的肺功能在较长时间后出现显著下降，特别是在TV、MV和EF50等关键指标上。（见表三）

4.2.2 SD大鼠

4.2.2.1肺功能变化趋势：

空白组：肺功能未见明显变化。

BL-L组和BL-H组：肺功能呈下降趋势。

关键时间点对比：

第0天：BL-L组和BL-H组与空白组肺功能无显著差异。

第10天：BL-L组和BL-H组的TV较空白组显著降低（P<0.01）。

第21天：BL-L组的TV和MV较空白组显著降低（P<0.05, P<0.01）；BL-H组的TV也显著降低（P<0.01）。

4.2.2.2结论：

实验处理导致SD大鼠的肺功能在短时间内（第10天）即出现显著下降，特别是TV指标，且这种下降趋势持续至实验结束（第21天）。（见表四）

4.2.3 羟脯氨酸含量分析

实验结果：

在第21天取材后，C57BL/6J小鼠和SD大鼠的BL组（低剂量博来霉素处理组）与BLH组（高剂量博来霉素处理组）的羟脯氨酸含量均较空白组显著升高（P<0.05, P<0.01）。

羟脯氨酸含量的升高呈现出剂量依赖性，即随着博来霉素剂量的增加，羟脯氨酸含量也相应增加。（见图三）

4.2.4.2SD大鼠：

空白组：同样，肺组织结构完整，未见明显炎性细胞及纤维化病灶。

BL-L组和BL-H组：HE染色显示肺组织结构破坏、肺泡壁增厚、炎性浸润。Masson染色显示蓝色染色的纤维条索形成及胶原沉积，病变主要集中在器官周围，向边缘扩散。(见图5A)

定量分析：与空白组相比，BL-L组和BL-H组的肺泡炎及纤维化程度也显著升高（P<0.01）。(见图5B）

5.讨论

肺纤维化由多因素引发，导致不可逆性肺组织瘢痕化，严重影响肺功能，甚至致命。其机制未明，治疗药物匮乏，研究其机制及新药开发具有重要意义。博来霉素因其诱发肺纤维化的特性，成为常用的建模药物。本研究采用经口咽部无创气管滴注法，对比3mg/kg和5mg/kg博来霉素剂量对C57BL/6J小鼠和SD大鼠的影响。结果显示，小鼠对博来霉素耐受性较强，而大鼠更敏感。肺功能检测显示，低剂量博来霉素诱导的小鼠模型肺功能可能恢复，而大鼠模型则持续受损。HYP水平及病理分析均证实两剂量均能诱导肺纤维化，但表现略有差异。综合考虑，建议小鼠模型采用5mg/kg，大鼠模型采用3mg/kg博来霉素。然而，本研究动物种类有限，观察期较短，模型稳定性需进一步验证。

文献参考：燕苗苗,赵亚昆,王搏,等. 博来霉素诱导大鼠与小鼠肺纤维化模型的评价 [J]. 中国实验动物学报, 2023, 31(2):179-186.

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