MicrRNA-134/CREB/pCREB通路在癫痫中的表达及意义

 目的：探讨 miR-134、CREB,pCREB 在疯痫大鼠海马及难治性癫痫患者颞叶脑组织中的表达及意叉。

1.1材料与方法

1.1 实验动物

种类与来源：42只清洁级成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。

体重与年龄：体重(200±20)g，6~8周龄。

饲养环境：环境温度22~26℃，湿度50%-60%，12小时昼夜循环，自由进食及饮水。

分组：按随机数字表法分为对照组及癫痫点燃后1、3、7、14、30、60天组，每组6只。

1.2氯化锂—匹罗卡品癫痫模型

造模方法：

（1）腹腔注射氯化锂127mg/kg，16-20小时后注射匹罗卡品35mg/kg。

（2）注射匹罗卡品前30分钟注射阿托品1mg/kg以减轻胆碱能副作用。

（3）发作严重程度按Racine分级，连续3次达到IV-V级发作即认为达到癫痫持续状态（SE）。

（4）SE点燃后45分钟腹腔给予地西泮10mg/kg终止发作，未达到标准者反复给予匹罗卡品直至SE出现，总量不超过50mg/kg。

（5）对照组注射生理盐水代替匹罗卡品，其余处理同癫痫组。

1.3 人颞叶组织标本

难治性癫痫组：

来源：第三军医大学新桥医院，14例难治性癫痫患者颞叶病灶标本。

纳入标准：正规使用3种及以上AES药物，血药浓度维持水平，2年不能控制癫痫发作，每月发作4次以上，排除其他中枢神经系统疾病。

病理改变：神经元缺失、变性、胶质细胞增生。

患者平均年龄：20.38±10.22岁。

非癫痫对照组：

来源：第三军医大学新桥医院神经外科，10例颅脑损伤患者标本。

纳入标准：脑外伤引起颅内高压需外科开颅减压，无癫痫病史和家族史，术后病理检查脑组织结构正常。

患者平均年龄：36.80±13.01岁。

1.4 试剂与材料

匹鲁卡品、RNA提取及PCR相关试剂盒特异性反转录及PCR引物、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、CREB、pCREB多克隆一抗、NPY。

1.5 组织处理

将人脑颞叶皮质标本分成两部分，一部分保存于液氮中用于后续实验。

1.6实时荧光定量PCR检测

RNA提取：采用RNAiso Plus试剂，按说明书操作，RNA样本保存于-80℃。

反转录：使用TaKaRa反转录试剂盒，条件为37℃ 60min，85℃ 5s。

PCR反应：体系为20μL，包含RTIL、上下游引物、SYBR Green荧光染料及去离子水。反应条件为95℃ 30s，然后95℃ 5s，60℃ 20s，共40个循环。

结果分析：用Bio-Rad CFX Manager软件分析扩增和溶解曲线，结果用平均2^-ΔΔCT法分析。

1.7 Western blot 检测

目的：检测人颞叶皮质组织和大鼠海马组织中CREB及pCREB蛋白的表达水平。

方法：

（1）提取全蛋白，BCA法检测蛋白浓度。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，全湿法转膜。

（3）封闭、一抗孵育（CREB、pCREB）、二抗孵育。

（4）ECL显色，Quantity One软件分析条带光密度值。

结果：

（1）大鼠癫痫模型中，CREB和pCREB在多个时间点（3d, 7d, 14d, 60d）的表达较对照组显著增加。

（2）难治性癫痫患者颞叶皮质中CREB和pCREB的表达也显著高于非难治性癫痫对照组。

1.8 免疫组织化学检测

目的：在组织切片中定位CREB和pCREB的表达。

方法：

（1）组织切片脱蜡、脱水、抗原修复。

（2）封闭、一抗孵育（CREB、pCREB）、二抗孵育。

（3）DAB显色，苏木素复染，封片。

（4）奥林巴斯BX51系统采集图片。

结果：

（1）大鼠癫痫模型脑组织中，CREB阳性表达主要集中在海马区的齿状回、CA1及CA3区神经元胞核。

（2）难治性癫痫患者颞叶皮质中CREB阳性表达也显著增加，主要存在于神经元细胞核中。

1.9 统计学分析

使用SPSS17软件，数据正态性检验，均数±标准差表示，t检验或单因素方差分析（LDS检验），P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR测定miR-134

大鼠癫痫模型在点燃后，miR-134的表达水平在多个时间点（72h、7d、14d、60d）较正常对照组显著降低，其中14d时达到最低点。这一发现表明，miR-134可能在癫痫病理过程中发挥重要调控作用，其表达下调可能与癫痫的发作和维持有关。此外，难治性癫痫患者颞叶皮质中miR-134的表达也显著降低，进一步支持了miR-134在癫痫病理机制中的潜在作用。（见图一）

2.2 Western blot 检测结果

2.2.1 CREB在人颞叶皮质及癫痫大鼠脑组织中的表达
     CREB在癫痫大鼠脑组织的多个时间点（3d、7d、14d、60d）表达显著增加，而在1d和30d时表达水平与对照组相当。同样，在难治性癫痫患者颞叶皮质中，CREB的表达也显著增加。这些结果提示，CREB可能参与癫痫的病理过程，其表达上调可能与癫痫的发作后神经元适应性反应或神经可塑性变化有关。（见图二）

2.2.2 pCREB在人颞叶皮质及癫痫大鼠脑组织中的表达

     pCREB（CREB的磷酸化形式，代表其活性状态）在癫痫大鼠脑组织各时间点（1d、3d、7d、14d、30d、60d）均表现出显著增加，同样，在难治性癫痫患者颞叶皮质中，pCREB的表达也显著增加。这一发现强调了pCREB在癫痫病理过程中的关键作用，其活性增强可能介导了下游基因的表达变化，从而参与癫痫的病理生理过程。（见图三）

2.3 免疫组化结果

2.3.1 CREB在癫痫大鼠脑组织中的表达
     免疫组化结果显示，癫痫大鼠海马区的CREB阳性表达主要集中在齿状回、CA1及CA3区的神经元胞核，且癫痫模型组在72h时间点的CREB表达明显多于正常对照组。这一发现与Western blot结果相一致，进一步证实了CREB在癫痫病理过程中的表达变化。

2.3.2 pCREB在癫痫大鼠脑组织中的表达
     与CREB类似，pCREB在癫痫大鼠海马区的阳性表达也主要集中在齿状回、CA1及CA3区的神经元胞核，且痫型组在72h时间点的pCREB表达明显强于正常对照组。此外，人颞叶皮质中pCREB的阳性表达也主要存在于神经元细胞核中，且癫痫组明显多于对照组。这些结果强调了pCREB作为活性形式的CREB在癫痫病理过程中的重要作用。

3.讨论

颞叶癫痫与miR-134、CREB及其磷酸化形式pCREB的表达变化密切相关。miR-134在癫痫中表达下调，可能通过解除对CREB的抑制，促进CREB及pCREB的表达和活性，进而调节突触可塑性，促进苔藓纤维出芽和异常神经网络形成。本研究发现，在难治性癫痫患者及癫痫大鼠模型中，miR-134表达降低，而CREB和pCREB表达增加，提示miR-134/CREB/pCREB通路可能参与癫痫慢性期的病理机制。这一发现为深入研究癫痫的发病机制及开发新的治疗靶点提供了理论基础，但还需进一步探讨该通路在不同种属脑组织中的具体调控机制。

文献参考：王倩,陈阳美,郭靖,杨小兰,谢运兰MicroRNA-134/CREB/pCREB通路在癫痫中的表达及意义门.中国实验动物学报,2014.22(6):28~33.

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