肺纤维化造模 

肺纤维化（PF）是一种严重的间质性肺疾病，其核心特征是肺间质中巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞的浸润，纤维母细胞的异常增生，以及纤维结缔组织的过度沉积。这种病理过程导致肺泡炎的广泛分布和肺泡结构的严重紊乱，最终引发肺间质纤维化，成为多种慢性肺部疾病的最终归宿。

鉴于体外研究在肺纤维化领域的局限性，与人肺纤维化病理过程相似的动物模型显得尤为重要。目前，科学家们已经成功构建了多种肺纤维化动物模型，主要分为基因相关模型和非基因相关模型两大类。基因相关模型通过基因工程技术在动物体内模拟肺纤维化的基因变化，而非基因相关模型则在不改变遗传背景的前提下，通过环境因素、药物毒物或其他外部因素来诱导肺纤维化的发生。这些模型为我们深入了解肺纤维化的发病机制、评估治疗方法和药物疗效提供了重要的研究平台。

1. 基因相关方法致肺纤维化模型

SD大鼠细胞因子过表达法致肺纤维化模型步骤

前期准备：
AdTGF-β1223/225腺病毒载体和腺病毒空载体需保存在-70℃条件下。在使用前，这些病毒载体将通过特定的病毒稀释液进行稀释，以达到1×10^9pfu的浓度。病毒稀释液的制备涉及三种溶液（A、B、C）。A液是由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4和双蒸水配制而成，B液为CaCl2·2H2O溶液，C液为MgCl2·6H2O溶液。每种溶液都需要单独高压消毒，然后按照98 mL A液、1 mL B液、1 mL C液的比例混合，作为病毒稀释液备用。

操作步骤：
选择体重在（250±15）g范围内的SD大鼠作为实验对象。首先，通过腹腔注射速眠新（剂量为0.4 mL·kg^-1）进行麻醉。在无菌条件下，切开大鼠颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉，以充分暴露气管。随后，通过喉头下方一次性注入0.4 mL的AdTGF-β1223/225腺病毒液。手术后6小时，观察并记录大鼠的生理反应。

模型验证：
在造模后的第7天、第14天和第21天，分别对大鼠进行麻醉。然后，通过左心室插管灌流温热的生理盐水，并剪开右心耳放血。待流出液变澄清后，再缓慢灌流4%多聚甲醛水溶液（流速为200 mL·30 min^-1）。小心地摘取整个肺和心脏，通过气管恒压（2 452 Pa）灌注4%多聚甲醛固定液10分钟，以恢复肺泡的扩张状态。沿纵轴切取肺组织，并将其浸入4%多聚甲醛固定液中固定24小时。接着，进行常规的石蜡包埋、石蜡切片、HE染色和Mallory染色。最后，通过光镜观察并拍摄切片图像，以验证模型的成功建立。

靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法

靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法旨在通过转基因技术模拟肺纤维化的病理过程。这一方法涉及将白喉毒素受体与Ⅱ型肺泡上皮细胞启动子通过基因工程技术融合，并引入小鼠体内。随后，白喉毒素不断作用于这些转基因小鼠，触发对Ⅱ型肺泡上皮细胞的特异性损伤，进而引发肺纤维化的病理改变。

除了上述的转基因技术外，基因编辑技术也被用于构建肺纤维化动物模型。通过精确敲除或导入与肺纤维化相关的特定基因，如肺表面活性蛋白C、肺表面活性蛋白A2（SFTPA2）、端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶RNA复合酶（TERC），可以模拟肺纤维化的遗传基础。这种方法的目的是研究这些基因在肺纤维化过程中的作用，以及探索基于基因治疗的新策略。

转基因方法的优势：

基因技术造模相较于传统的造模方法，在靶点选择上更加明确和精确。这一特性对于筛选具有抗纤维化效果的药物至关重要，因为它能够更直接地指向肺纤维化的核心病理机制。此外，转基因方法还允许通过诱导时间特定的启动子来模拟肺纤维化晚期的临床症状，为研究人员提供了一个更为接近实际疾病进程的模型，从而更准确地评估药物疗效和疾病进展。

转基因方法的劣势：

尽管转基因方法具有诸多优势，但也需要考虑到其潜在的局限性。首先，介导转基因的病毒载体本身可能带有一定的危害性，这需要在实验设计和操作过程中予以严格控制。其次，人类肺纤维化的形成往往涉及多个基因和多种因素的复杂交互作用，而单一的基因模型可能无法完全模拟这种复杂性。因此，单一的基因模型与多基因相关的肺纤维化模型之间会存在一定的差异，这可能会影响实验结果的准确性和可靠性。

2. 非基因相关方法致肺纤维化模型

博来霉素诱导的肺纤维化模型

实验动物选择

选择8周龄、体重约为23克的C57BL/6小鼠作为实验对象。

实验材料准备

准备博来霉素（盐酸或硫酸博来霉素均可）、适当的麻醉剂、手术器械（包括手术剪、眼科镊）、缝合线以及1 ml注射器或微量注射器。

实验操作步骤

博来霉素溶液制备：

将博来霉素用生理盐水溶解，根据小鼠的体重计算所需剂量，通常在2-5 U/kg之间。注意不同来源的小鼠对药物敏感性可能有所不同，需通过预实验摸索合适剂量。

给药方式：

器官内给药：采用气管注射的方式，这种方式相比其他给药途径具有更高的成模率和更快的成模速度。

具体操作：

1. 首先，按照麻醉剂的使用剂量对小鼠进行麻醉。

接着，在颈部中线处切开皮肤，切口大小约为0.5-1 cm。

2.使用眼科镊轻轻分离出气管，操作时要轻柔以避免不必要的损伤。

3.使用1 ml或微量注射器（如胰岛素针）将制备好的博来霉素溶液（每只小鼠不超过0.2 ml）注入气管内。

4.注射完成后，缝合伤口，并将小鼠直立1-3分钟，期间可以轻微摇晃，以促进博来霉素在肺内的均匀分布。

观察与注意事项：

通常在给药后3天左右，小鼠会出现肺部损伤和体重降低等症状。纤维化的发展程度与博来霉素的剂量和溶液体积密切相关，一般在给药后7-21天出现。由于纤维化可能导致动物死亡率上升，需密切关注小鼠的健康状况，并采取相应的护理措施。

百草枯所致肺纤维化模型

临床研究已经证实人在口服百草枯后会造成不可逆性肺纤维化，因此，在动物实验中也有选择百草枯来进行动物造模，具体如下：

实验动物选择

实验选用了两组不同品种和体重范围的实验动物：

8周龄，雄性Wistar大鼠，体重220±20g左右

8周龄，雄性C57BL/6小鼠，体重23±2g左右

实验造模步骤

实验动物按照体重随机分组后，通过以下两种主要方法诱导肺纤维化模型：

腹腔注射法：

大鼠接受20mg/kg体重的某种药物（具体药物未提及）腹腔注射。

小鼠接受10mg/kg体重的相同药物腹腔注射。

注射后，经过一段时间后，动物体内将形成肺纤维化模型。

大剂量口服百草枯法：

口服百草枯是另一种造模方法，有报道称大鼠或小鼠口服50mg/kg的百草枯后，在120小时内即可观察到肺部纤维化的发生。

然而，百草枯因其对人体具有毒性，购买和使用时需要特别小心，并满足相应的条件。

目前，百草枯诱导的肺纤维化模型的使用频次相对较低，不如博来霉素诱导的模型普遍。

其他造模方法及模型优劣

除了上述两种主要方法外，研究中还采用了石棉、二氧化碳、FITC等物质来诱导肺纤维化模型。以下是这些模型的简要优劣评估：

石棉诱导法：石棉是传统的致肺纤维化物质，能够稳定地诱导肺纤维化，但模型形成时间较长，且石棉处理过程可能产生安全隐患。

二氧化碳诱导法：此方法可能在特定实验条件下快速诱导肺纤维化，但模型稳定性和可重复性有待进一步验证。

FITC诱导法：FITC（荧光异硫氰酸）可能通过免疫途径诱导肺纤维化，但具体机制尚未完全明确，且该方法在实验条件控制上可能较为严格。

综上所述，不同造模方法各有优劣，研究者应根据实验目的和条件选择合适的模型。