随着近年来大规模的集约化养殖，加强了动物之间疾病的传播率和扩散率，因此也受到广泛相关实验室科学家的关注，并发明了PCR检测诊断技术并为检验疫病提供了科学依据。这种技术操作简单、容易掌握、有极高的灵敏度并且结果可靠，但该方法较强的扩增能力也带来了一些令人头疼的问题，也就是易污染，极其微量的污染可能造成假阳性的产生。

PCR检测是聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术;它可看作是生物体外的特殊DNA的复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。这种技术被用在动物疫病的检测当中能够将动物的DNA片段无限放大，从而在动物疫病的防治过程中起到很好的效果，未来随着时代的进步实验室的环境会进一步得到改善。

一、引起PCR污染的原因

1. PCR试剂的污染
引起PCR污染的主要原因之一是PCR试剂的污染，做实验其基本的实验器材就是试剂，保护好相关的试剂器材，也就是直接减少了在实验中对污染物的接触。具体表现在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

2. 样本间的交叉污染
引起PCR污染的主要原因之二是样本间的交叉污染，在实验的标本储存的过程中，由于密封方法不当或是密封不够严密导致样本之間进行交互交叉感染，这是其中的原因之一，属于人为存储不当而导致的样本感染。还有比较重要的原因是来自于客观原因，或者也可以说是有人为所导致的，就是存储的容器被污染，主要是样本的容器外沾有标本而造成的相互交叉感染。又或者样本核酸模板在人为提取的过程中，由于移液枪的污染而导致样本间的污染等等因素，这些在人为的实验过程中经常会出现，如果要避免的话建议做实验的时候要留心，多注意细节以防样本交叉污染带来的实验结果有误。

3. PCR扩增产物污染
引起PCR污染的主要原因之三是PCR扩增产物污染，这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，也是最主要的污染原因之一。因为PCR产物拷贝量是非常大的，其拷贝量远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染很可能造成假阳，就可形成假阳性，形成污染源，对实验室环境带来极强的破坏性。

4. 操作者的污染
在实验的过程中，由于操作者过于注重操作的结果和效益，往往在实验的过程中就会因为心急造成误操作，或者自身的头发、皮肤等当中含有的细菌都会带来PCR的污染。这不仅仅是个人的实验室防护措施没有做好，更重要的是实验室的操作安全知识以及细节没有从整体上有清晰的认识，长时间这样开展实验肯定是对实验的不重视，其结果可想而知。

二、防止污染的措施

1. 对PCR实验室合理分区
防止污染的措施之一是对PCR实验室合理进行分区，这是最重要的防止污染的措施之一，能从根本上杜绝PCR实验室的污染。将实验室分为以下三个区域：第一，标本处理区，包括扩增摸板的制备;第二，PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增;第三，产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。在操作的过程中一定要将这些重要的工作区进行有效的隔离，操作的时候使用专业的器械，以防出现交叉感染。

2. 良好的实验室操作习惯
由于操作不当引起的实验结果和样本交叉污染的案例在科学实验室当中经常可见，不良的操作习惯在实验室搞科研是实在对科学不尊重的一种行为举动，因此在进入实验室操作之前一定要注意对自身进行全副的武装。在开始操作的时候还要养成良好的操作习惯，该将本次实验的器具放在哪里就放在哪里，不把器具混合交叉使用。

3. 合理的试剂分装与贮存
其次，相对来说比较有效的措施是要合理的试剂分装与贮存，在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染导致实验结果的失败，因此将所有的试剂进行小量的包装，而且将PCR反应液先行配置好再进行小量的分装，放在零下负20摄氏度的环境下进行保存，避免感染次数的增加。

4. 实验设计尽量减少PCR循环次数
最后是要在实验设计中尽量减少PCR循环次数，将PCR产物只要达到检测水平就可以了，这样就可以很好地避免高浓度大量的扩增产物带来的污染。但是一旦产生了污染就必须要立即追踪污染物，尽快找到污染的源头，从而尽快保证实验能够顺利开展。这个防治对策在经过多次的验证后，多数实验科学家都表示十分有效，能够很好的减少PCR的污染。

三、污染的监测方法

1.阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。
但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2.阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增

四、污染后的处理方法

(1)环境污染

1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤。

2.紫外照射(UV)法：紫外波长(nm)一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列

(2)反应液污染

1.DNase I法：PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列。

2.内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶(如Msp I和Taq I等)，可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR。

3.紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。

4.g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。

4.g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。

在动物疫病PCR检测实验室的污染和对策当中格外要注意到的是要注意操作的规范性和严格性，目前引起 PCR污染的原因的主要原因都有 PCR试剂的污染、样本间的交叉污染、PCR扩增产物污染和操作者的污染，因此在实验的过程中一定要以严谨的科学的态度来对待每一场PCR检测实验，以防在实验当中由于个人主观上带来的样本交叉污染和实验室器具的混合使用，这些对于实验来说是毫无帮助的。所以在实验污染防治当中要养成良好的操作习惯，改变不良的操作陋习。